超声靶向破坏微泡定位释放技术促基因转染最佳参数的研究进展

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 超声靶向破坏微泡定位释放技术促 基因转染最佳参数的研究进展 摘要 运用超声靶向破坏微泡定 位释放技术（UTMD）最重要的是参数 的优化，应满足既可以获得高的转染效 率的同时又对大部分细胞没有损害。目 前许多研究都致力于将转染率高、组织 损伤小的转染参数进行优化，但影响转 染效果的因素有很多，如超声强度，占 空比，辐照时间，微泡浓度，微泡性质， 质粒浓度，不同细胞种类等，本文就目 前 UTMD 技术促基因转染最佳参数进 行综述，期望为 UTMD 更好的应用于 基因治疗提供研究基础。 中国论文网 /6/view-12955758.htm 关键词 超声；微泡；转染；参 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 数 中图分类号 R445.1 文献标识 码 A 文章编号 1673-7210（2017） 09（b）-0033-04 Research progress of ultrasound- targeted microbubble destruction technology promoting gene transfection with optimal parameters MA Jie MU Yuming Department of Echocardiograrhy， First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830011， China Abstract The optimization of parameters is the most important in ultrasound-targeted microbubble destruction （UTMD） ， this parameter should achieve both high transfection efficiency while at the same time most of the cells without damage. At present， many studies have focused on optimizing -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 the transfection parameters for those with high transfection efficiency and small tissue damage. However， there are many factors that affect the transfection effect， such asultrasound intensity， duty cycle， irradiation time， microbubble concentration， microbubble properties， plasmid concentration， different cell types. This article reviewes the best parameters of gene transfection in UTMD， and expectes to provide a basis for UTMD to be better applied to gene therapy. Key words Ultrasound； Microbubbles； Transfection； Parameter 超靶向破坏微泡定位释放技术 （ultrasound-targeted microbubble destruction， UTMD）是一种新型的无 创性基因转移技术，UTMD 介导的基因 治疗以其低免疫原性、非侵袭性、靶器 官高度特异性以及可以增强大分子通过 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 质膜穿透能力等特点，可明显提高基因 转染率。然而获得较高的基因转染率， 需要对有关转染参数进行系统研究并优 化，由于不同的转染参数对不同组织细 胞具有不同的生物学效应，而目前 UTMD 技术促进基因转染尚无统一优化 的参数指标，因此，深入研究最佳转染 参数以提高基因转染率成为目前的研究 方向，本文就此问题进行综述，期望为 UTMD 技术更好的运用于基因治疗奠定 基础。 1 UTMD 的概念 UTMD 是指在体内或体外以微泡 作为基因载体，在合适的超声辐照条件 下，微泡逐渐或突然活化或爆破，产生 一系列生物学效应，如一过性的使细胞 膜通透性增加，从而促进靶基因或药物 进入感兴趣细胞或组织1-3，且不会干 扰基因在细胞内表达，是一种理想的基 因载体传递方法4-5。研究表明超声破 坏微泡造影剂时，产生的机械作用和空 化作用可以增加细胞膜的通透性、导致 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 微血管破裂、内皮细胞间隙增宽，从而 促进外源性的目的基因进入靶细胞6-7， 增强目的基因的转染及表达效率8。 UTMD 作为一种非侵袭性的靶向基因传 递方法9-10，具有运输和释放特殊物 质到靶组织和靶器官的潜力11，可以 改变局部微环境12 ，可以促进干细胞 归巢13，已成为一种极具潜力的基因 传递方法。 2 UTMD 促进基因转染的机制 为了促进 UTMD 技术更好的发 展，了解 UTMD 机制并分析其在超声、 微泡、细胞和组织中复杂的交互作用， 才能更好地理解 UTMD 技术在基因转 染中的发展和作用14-17。UTMD 技术 的基本原理是在特定部位进行适当的超 声辐照，携带目的基因的微泡在特定部 位发生空化效应，使目的基因或药物到 达靶组织或细胞。空化效应是超声作用 于液体和气态夹杂物（空化核）之间的 一种物理现象，有两种类型的空化：稳 定空化和瞬时空化。在稳定空化中，由 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 于所施加的声压，空化核经历周期性和 规则的变化；在瞬时空化的情况下，虽 然空化核也受所施加的声压进行周期性 变化，但空化核的体积会迅速增大，继 而猛烈地爆破18 。微泡可以由脂质， 白蛋白，糖类，生物相容性聚合物和其 他材料组成19-20 ，由于其反射超声的 物理特性，传统上被作为超声对比剂； 微泡作为空化核可以在超声波作用下扩 张和收缩，当声压达到更高水平时就会 发生破裂，因此微泡作为基因载体可以 在感兴趣的位点以高的局部浓度释放， 通过外源性给予超声微泡来增加空化核 的数目极大程度地增加了超声辐照引起 空化效应的可能性21-22，UTMD 通过 空化效应可以增加细胞膜的通透性，增 加基因转染的有效性，是一种新颖的药 物和基因传递的方法。UTMD 技术已广 泛应用于各种体内和体外研究中23-25， 为靶向基因治疗提供了一个极具前景的 方式26-27。 3 UTMD 促骨髓 干细胞及神经干细胞基因转染最佳参数 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 的研究 UTMD 的参数变化可以导致各种 不同的声孔效应，许多研究都致力于通 过发现最佳参数来减低对细胞的毒性和 增加转染率，即基因转染的最佳条件是 使细胞膜的通透性在不引起细胞不可逆 损伤的前提下尽可能的增大。干细胞在 组织修复和器官再生的基因治疗中具有 很多优势，因此研究超声辐照频率、辐 照强度、辐照时间、占空比、微泡浓度， 通过固定其中某些参数，寻找其他参数 的最佳配比，提高干细胞的基因转染率， 为基因治疗提供实验基础。Li 等28利 用 UTMD 技术介导增强型绿色荧光蛋 白（pEGFP-HGF ）标记的肝细胞生长因 子（HGF）转染鼠骨髓间充质干细胞 （BMSCs） ，固定超声辐照频率 1 MHz，占空比 10%，筛选出超声辐照强 度=0.6 W/cm2，微泡浓度 =106/mL，辐 照时间=30 s 时，转染率达最高水平且 对 BMSCs 活力没有影响。陈玲玲等29利 用 UTMD 介导 5-氮杂胞甘转染人骨髓 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 间质干细胞（MSCs） ，固定超声辐照频 率 1 MHz，占空比 50%，筛选出辐照强 度为 0.55 W/cm2，辐照时间为 30 s，微 泡数/干细胞数比值为 50 的最佳转染参 数，此条件下 MSCs 的活性无明显抑制 且有一定的空化效应。研究发现，微泡 浓度不同对神经干细胞存活率与基因转 染率的影响较大，固定超声声强 1.5 W/cm2，照射时间 60 s，占空比为 10%，微泡浓度为 20%，细胞存活率及 基因转染率较微泡浓度为 10%、30%高， 可作为神经干细胞基因转染的适宜条件 30。 4 UTMD 促肿瘤细胞基因转染的 最佳参数的研究 基因治疗为目前一些无法治愈的 疾病，如肿瘤、糖尿病、遗传性疾病， 提供了一种新的治疗方法。有效的基因 转染也需要较高的质粒浓度，通过优化 超声参数，微泡浓度，质粒浓度等影响 转染率的因素，UTMD 技术可提高肿瘤 组织血管通透性，从而促进病变区域血 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 药浓度的上升及目的基因的表达，进而 加强肿瘤治疗效果。陈智毅等31选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 三种细胞系为 研究对象，超声强度为 1.0 W/cm2，系 统研究不同参数下的细胞活力及两种 DNA 质粒红色荧光蛋白质粒 （DsRed）和荧光素酶质粒（pCMV- LUC）的基因转染情况，优化 UTMD 的转染条件（质粒浓度、占空比、辐照 时间） ，研究表明随着质粒浓度的增加， 基因转染率逐渐增高，质粒浓度达 到 30 g/孔时目的基因转染率达最高； 20%占空比的转染率显著提高；辐照 3 min 时基因表达率最高，细胞存活率无 明显下降，为最佳辐照时间。何颖等 32在超声联合脂氟显微泡转染 HepG2 细胞的参数优化研究中发现，超声强度 1.2 W/cm2、占空比为 20%，辐照时间 小于 90 s 时 HepG2 细胞转染率相对较 高；刘同刚等33 研究发现在超声声强 为 2 W/cm2、占空比为 20%、照射时间 为 60 s 时，HepG2 细胞的转染率最高， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 这与何颖等的研究结果相同。马少增等 34用 72 只肝癌大鼠模型将 UTMD 技 术进一步优化，促进肿瘤靶区微血管通 透性的提高，研究表明当微泡剂量为 30 L/kg 联合辐照时间 10 min、机械指数 =1.3 可最大限度地提高肿瘤组织的血管 通透性。 5 UTMD 促其他种类细胞基因转 染的最佳参数的研究 UTMD 技术运用于各种体内体外 实验中，很多研究仅叙述了部分参数， 缺乏对转染参数的系统性研究和优化， 通过对超声参数，微泡浓度，质粒浓度， 细胞状态的全面优化，在不同种类的细 胞中均可获得的较高的转染率。Zhou 等35利用 UTMD 技术介导 hAng-1 基 因体外转染 293T 细胞，超声辐照频率 在 0.52 MHz 范围内，通过测定细胞 转染率和细胞活力来测定最佳转染参数， 研究表明，超声辐射强度1.5 W/cm2， 辐照时间30 s，微泡浓度20%，hAng- 1 表达显著下降，伴随细胞死亡；质粒 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 浓度 80%，研究表明相同转染条件下悬 浮状态细胞转染率及存活率明显优于贴 壁状态，并且通过优化质粒、微泡浓度 可进一步提高基因转染率和细胞存活率。 目前大多数研究通过先固定某个转染参 数，然后寻找与之相匹配的其他最适转 染参数，以获得较高的基因转染率。丁 尚伟等37在不固定单个参数的前提下， 利用参数之间的相互组合，发现质粒浓 度固定为 15 g/mL、超声辐照频率为 1 MHz、辐照强度为 2.0 W/cm2、辐照时 间 45 s、微泡浓度 30%，293T 细胞的 转染效率最佳，细胞存活率最高。Li 等 38利用 UTMD 介导 PHD2-shRNA 转 染大鼠心肌细胞（H9C2） ，研究发现固 定超声频率=1 MHz，占空比=20% ，当 超声辐照强度为 1.5 W/cm2，辐照时间 为 45 s，微泡浓度为 300 L/mL，质粒 浓度为 15 g/mL，转染效果最佳并对 H9C2 细胞活力没有影响。Shi 等39通 过 UTMD 在 Tregs 中评估了金属蛋白酶 组织抑制剂（Timp3）小干扰 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 RNA（siRNA ）质粒传递的适当参数， 研究表明超声联合微泡显著提高了 Tregs 的转染率；超声和微泡均可影响 Tregs 增殖，Tregs 转染率最佳条件为 10%微 泡，暴露时间为 150/180 s，超声机械指 数为 1.4。 6 小结与展望 UTMD 技术是一种介导基因转染 的有效方法，不同参数下转染率差别较 大，优化参数有利于促进基因转染。就 如其他新颖的基因治疗方法一样， UTMD 技术也面临着诸多挑战，超声空 化现象可以提高基因的转染效率