黑曲霉柠檬酸积累代谢机制研究进展

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 黑曲霉柠檬酸积累代谢机制研究进 展 摘要：柠檬酸是能量代谢的产物， 只有在阻止正常代谢进行的情况下柠檬 酸才可能大量积累。20 世纪 30 年代人 们已经初步掌握了黑曲霉（Aspergillus niger）柠檬酸的发酵条件并进行规模化 生产，然而对柠檬酸积累机理的研究还 不是很透彻，黑曲霉柠檬酸积累引起了 众多研究者的关注。另外，一些新的生 物技术如基因组学技术的应用也为黑曲 霉柠檬酸代谢的深层研究提供了可能。 综述了黑曲霉柠檬酸代谢过程中己糖的 输送、糖酵解和能荷调节机制的研究进 展。 中国论文网 /8/view-12792928.htm -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 关键词：黑曲霉（Aspergillus niger） ；柠檬酸积累；代谢机制 中图分类号： TQ921+.1；TS261.1+2 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）07-1489- 04 柠檬酸（2-羟基- 丙烷-1，2，3- 三羧酸）最初被认为是柑橘属植物的一 种组分，作为三羧酸循环（TCA）的中 间产物被发现已经近 70 年。柠檬酸结 合低毒、可口性和美味于一体，已成为 一种广泛的食品添加剂。并且柠檬酸能 够螯合铁、铜等重金属离子，因此在金 属离子催化的氧化反应过程中，对油、 脂肪和抗坏血酸的稳定性具有重要的作 用，已被广泛应用于医药和化妆品行业 中1。 目前，柠檬酸全世界消耗量已达 120 万 t，年产量达 160 万 t，市场贸易 量为 90 万 t 以上，且每年以 7%的速度 递增。虽然柠檬酸有一小部分在酵母发 酵中产生，但大多数发生在真菌黑曲霉 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 （Aspergillus niger）中。数十年来，黑 曲霉积累柠檬酸的生化代谢机制引起了 基础科学和应用科学研究者的广泛关注， 并开展了大量研究。本文结合近些年来 黑曲霉合成柠檬酸代谢机制的研究进展， 对其进行总结概括，以求更深入理解其 内在机理。 1 黑曲霉合成柠檬酸的途径 自 1940 年 TCA 学说建立以来， 柠檬酸的发酵机理逐渐被人们所认识。 Cleland 等2的研究表明柠檬酸的合成 过程包括葡萄糖酵解的分解代谢。由于 柠檬酸合成酶位于线粒体中，合成的草 酰乙酸并不立即参与柠檬酸合成酶的反 应，而是首先被细胞质中的苹果酸脱氢 酶催化形成苹果酸，进而通过苹果酸- 柠檬酸反向转运进线粒体（图 1） 。由图 1 可知，柠檬酸是整个 TCA 代谢过程中 的中间产物。在柠檬酸积累过程中，只 有当黑曲霉顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢 酶活性很低，而柠檬酸合成酶活性很高 时才有利于柠檬酸的大量积累。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 2 黑曲霉合成柠檬酸的代谢调控 2.1 葡萄糖的吸收 对于柠檬酸发酵，由于黑曲霉在 以葡萄糖和果糖为碳源时能够很好地生 长，所以通常采用己糖为碳源。对于工 业用蔗糖，一般采用在低 pH 条件下高 温灭菌或者利用细胞外的转化酶水解为 单糖。葡萄糖吸收主要依靠两种亲和性 不同的运载体的被动扩散作用。 Vankuyk 等3发现了一个由 mstA 编码 的高亲和性的运载体，碳源浓度较低时 该高亲和性运载体就能够生成，它能够 催化单糖/H+交换，其 Km 值为 2510 mol/L，试验发现 pH 降低或者柠檬酸 浓度升高会影响该运载体的活性。 葡萄糖达到 15%（W/V）时，黑 曲霉内除高亲和性运载体外，还生成一 种低亲和性的运载体，该低亲和性运载 体受 pH 和柠檬酸的影响比高亲和性运 载体要小。低亲和性运载体的 Km 值为 360 mol/L，远比高亲和性运载体大。 借助同源构巢曲霉的基因分析发现，低 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 亲和力运载体可能有 mstE 基因编码， mstE 基因的表达随葡萄糖浓度的升高 而加强。 需要说明的是，这两种运载体提 供的是促进扩散而非主动运输。促进扩 散和主动运输均与底物葡萄糖浓度呈非 线性关系，但是简单扩散却是线性关系。 Wayman 等4的试验发现葡萄糖的吸收 率与葡萄糖浓度为简单的线性关系而不 是非线性模式。即使底物中柠檬酸的浓 度很高，且这种高浓度的柠檬酸对运载 体有抑制作用，但葡萄糖吸收的速率却 不受限制5。 2.2 糖酵解的调节 发酵初期磷酸戊糖途径占主要部 分，黑曲霉生长期间几乎全部 TCA 酶 的含量都很高，此时大量的葡萄糖被用 于黑曲霉菌株的生长。24 h 后开始有柠 檬酸生成，如图 1 所示，在柠檬酸发酵 初期，柠檬酸通过 TCA 循环转换为 - 酮戊二酸。NAD-和 NADP-专一性异柠 檬酸脱氢酶此时具有很高的活性。可以 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 看出，柠檬酸积累的最初阶段并没有阻 断 TCA 循环。然而此时柠檬酸产量比 理论值要高，这可能是氨基糖的瞬时积 累及释放所致6。在柠檬酸积累的诱导 期间，延胡索酸和异柠檬酸减少，丙酮 酸、草酰乙酸和柠檬酸增加。这种中间 产物水平的短暂变化主要是因为 -酮戊 二酸脱氢酶的减少，进而导致琥珀酸、 延胡索酸的水平降低。同时由于酶解作 用强烈使丙酮酸和草酰乙酸增加，这为 柠檬酸的积累提供了条件7。 糖酵解的调节可以在不同的层面 上进行：转录水平调节；利用特定效应 因子以及翻译后修饰调节别构酶活性 8，9。对糖酵解调节酶基因的研究表 明己糖激酶、葡糖激酶、丙酮酸激酶的 合成与菌体外部环境有关，将黑曲霉置 于葡萄糖和果糖碳源时能够显著激发转 录过程并进而刺激这些激酶的生成。 2.2.1 己糖激酶和葡萄糖激酶 己 糖的磷酸化由己糖激酶和葡萄糖激酶共 同作用。但是两种酶的基因彼此孤立， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 动力学决定性因素也不同。在激活的碳 代谢条件下，两种酶都可以组成型表达， 只不过己糖激酶拥有更多的特异性底物。 果糖可以被己糖激酶磷酸化，但是反应 很慢，在细胞中可以忽略不计。葡萄糖 激酶能够抵抗不同效应因子的抑制，但 pH 稍微下降即容易被破坏。另外糖浓 度低时，无论果糖还是葡萄糖均能被己 糖激酶磷酸化并且没有明显的先后次序。 己糖激酶还可以被 6-磷酸海藻糖（一种 海藻糖生物合成的中间产物）强烈抑制。 但 6-磷酸海藻糖只存于发酵的 48 h 以 内，在被 cAMP 依赖的蛋白激酶 （PKA）磷酸化后即被中性海藻糖酶水 解。6- 磷酸海藻糖的水解可以使己糖激 酶不再受到抑制，大量的果糖和葡萄糖 被磷酸化，并可能最终促使磷酸戊糖途 径向糖酵解途径转变10 。 2.2.2 磷酸果糖激酶 磷酸果糖激酶（PFK ） 是糖酵解途径中的关键酶，它催化糖酵 解的第一步不可逆反应，利用 Mg-ATP 磷酸化果糖-6-磷酸形成果糖-1，6 二磷 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 酸并释放副产物 Mg-ADP。由于 PFK 既能保证高的糖酵解通量又能提高细胞 内柠檬酸浓度，因而受到众多研究者的 关注。 磷酸果糖激酶被正常生理浓度的 柠檬酸（15 mmol/L）所抑制。但是 在发酵条件下，这种抑制作用被许多正 向效应因子（NH4+，AMP，Fru-2，6- P2）所中和。碳源的浓度也可能对此有 作用，这是因为处于高浓度蔗糖或者葡 萄糖中的黑曲霉，其细胞内 Fru-2，6- P2（磷酸果糖激酶活化因子）浓度同样 会升高。用 1-13C 葡萄糖的 NMR 研究 证实了果糖-6-磷酸为低糖条件下的主控 步骤，但在高糖浓度下主控步骤下移到 3-磷酸甘油醛脱氢酶11 。 NH4+能有效解除柠檬酸和 ATP 对 PFK 的抑制。细胞内 NH4+的浓度处 于生理水平时，PFK 对柠檬酸不敏感。 当 NH4+被消耗时溶液的 pH 会有所下 降，这对柠檬酸发酵是有利的。 最近 Legi？la 的研究发现 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 PFK1 翻译后修饰会产生一个短的活性 片段。首先通过特定蛋白酶将分子量为 85 u 的原蛋白水解得到无活性的 49 u 的 片段；第二步由 cAMP-依赖蛋白激酶 （PKA）使蛋白分子磷酸化，从而得到 短的有活性的 PFK1 片段 8，9 。去除 具有柠檬酸结合位点的酶的 C 末端并保 留活性 N-末端部分可以使蛋白既能拥 有酶的活性的同时又不受柠檬酸的抑制。 与原酶相比，该活性片段被果糖-2，6- 二磷酸、AMP 和 NH4+激活后活性更高， 并且对 ATP 抑制作用响应不明显。同 时为了避免复杂的翻译后修饰自发进行， 必须对活性短的 PFK1 片段的编码基因 进行修饰。Capuder 等12筛选出能够改 变 PFK1 活性的短片段然后用谷氨酸代 替相应的苏氨酸终止磷酸化。修饰后的 基因能够直接表达而不受柠檬酸抑制。 2.2.3 丙酮酸激酶 虽然 PFK 是 糖酵解中最复杂的调控酶，但通常催化 糖酵解的第三步不可逆反应的丙酮酸激 酶控制细胞内糖酵解的速率。PKIA 基 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 因控制编码丙酮酸激酶，这种酶由分子 量为 58 u 的单体构成。酶动力学研究进 一步发现果糖 1，6-二磷酸能够阻止纯 化阶段丙酮酸激酶的失活。有趣的是， 对丙酮酸激酶有明显抑制的 ATP 对 6- 磷酸-1-激酶却没有任何抑制，相反活性 还略有提高。丙酮酸激酶一直被认为是 调控柠檬酸合成阶段的重要酶，但是 Meixner-Monori 等13发现提纯后的丙 酮酸激酶受到代谢程度的影响很小。并 且 Ruijter 等14发现无论是单独还是同 时扩增 PFK1 和 PKIA 的基因，柠檬酸 积累的产率都没有增加。这可能验证了 Torres 等15的计算必须同时至少 增加 7 个糖酵解酶的活性才能获得较为 显著的柠檬酸积累。 2.3 能荷调节 葡萄糖进行糖酵解途径会产生一 定量的 NADH，NADH 必须及时经过电 子传递转化为 NAD+才能保证黑曲霉菌 体内氧化还原电位的平衡。NADH 泛醌 氧化还原酶全部失活时才能使柠檬酸产 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 率提高。这是由于 NADH 失去的电子 经过呼吸链会产生 ATP，过量的 ATP 会抑制磷酸果糖激酶的活性，不利于糖 酵解的顺利进行。研究发现，黑曲霉中 除了有一条正常的呼吸链外还有一条受 水杨酸氧肟酸 （SHAM）抑制的侧呼 吸链，黑曲霉发酵后期柠檬酸的合成主 要是通过侧呼吸链完成的，缺氧会造成 侧呼吸链不可逆而失活16。 在柠檬酸生产阶段，大量的 NADH 通过侧呼吸链被氧化（图 2） 。 高活性的侧链氧化酶将多余的 NADH 氧化，这样不仅不会产生多余的 ATP， 还能够保证细胞内的氧化还原电位的平 衡。侧链氧化酶是在细胞质合成后转移 到线粒体中的，Hattori 等 17研究发现 柠檬酸生成时侧链氧化酶仅由侧链氧化 酶基因（aoxl）的转录水平调节。 ODonnell 等18研究了氧压增 强时侧 NADH 脱氢酶的作用，发现增 加溶氧含量能够使活性氧（ROS）浓度 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 和抗氧化酶活性快速提高，也使细胞内 蛋白浓度下降，从而导致 ATP 下降。 过量的氧环境加速了细胞的衰老和死亡。 分析认为在过量溶氧条件下为了维持低 浓度的 ROS，侧 NADH 脱氢酶的活性 显著增加，但是这也降低了机体合成蛋 白的能力，从而无法合成足够的 ATP。 3 小结与展望 荷兰工业化学公司 DSM 已经完 成了黑曲霉基因组测序的工程19。黑 曲霉基因组约 3 390 万个碱基对编码了 14 000 多个基因。其中大