2-丙基戊酸和5-氮杂胞苷对ips细胞诱导率影响的设计书

1 2胞诱导率影响的设计书 第一部分 文献综述 1 胞发展简介 1.1 胞的诱导 胞的诞生 成熟的体细胞由分化的状态逆转到未分化状态的过程称之为细胞重编程，细胞重编程现象最早在核移植实验中被发现。细胞重编程的方法包括体细胞核移植、 扰细胞质重编程技术、多能干细胞和体细胞融合、多能细胞的提取物与体细胞共孵育等。其重编程过程包括染色体结构重建、 基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复以及 x 染色体失活等。重编程后，体细胞核 会忘却原先体细胞留下的记忆重新进人发育程序。 都通过自己的实验诱导体细胞重编程成功。但是这些方法最大的缺点就是供卵缺乏、伦理道德及政府法规的限制等。因此科学家们努力寻求从法律、道德和伦理等方面更易被人们接受的体细胞核重编程的方法。 细胞核移植和干细胞这两个各自迷人的领域，在 2006 年发生了非常引人注目的碰撞。一些重大的发现为这次事件铺平了道路。正如两栖动物中一样，细胞核移植进入小鼠卵母细胞后表明体细胞核重编程成为多能肽。 2006 年 8 月，通过对卵母细胞和胚胎干细胞中涉及细胞重编 程的细胞因子的深入分析和研究，日本科学家 究小组将 24 种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定有 4 种转录因子组合 可将成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(胞。它的诞生仿佛给沉寂一时的国际干细 2 胞研究打入了一剂强心剂 1。 入 胞的外源转录因子 通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (胞 ) 样 的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (胞 )，这一方法被称为 术。 胞除了不能生成胚胎以外，可以产生所有的细胞，如果用于医疗，那么理论上可以治愈所有疾病 凡是不好的组织都去除，替换为重新生长的正常组织。它的功能几乎可以和 胞 相媲美。 自从 胞涉及道德伦理的问题以来 ，科学家用其来产生新生组织的想法就一直不能实施。而 其突破伦理障碍的面貌改变大家对干细胞的看法，无疑， 伟大的发现，它让科学家们可以更深入地了解我们的细胞。也让干细胞从理论研究到临床应用的步伐加快了许 多，直接将病人的成体细胞改造成干细胞， 比再培育一个小孩取干细胞更符合伦理道德要求，也突破了移植排斥的障碍。 胞和 胞具有相同的基因。不同的是 胞中与细胞多能性有关的基因能够表达，而这些因子就是 分化的细胞中这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外源基因来激活活体细胞中的多能性基因。从而使体细胞从分化状态重编程为多能干细胞。 试验中所用 4 种转录因子在诱导过程中分别起不同作用： 族的转录因子 ,维持细胞的多能性 ,是体细胞诱导为 胞所必须的基因。在小鼠和人的 胞中 , 达的抑制将会导致自发性分化为滋养层细胞。 实验结果表明 ,够维持 胞未分化状态并促进其增殖 ,并认为 活化是重编程为多能干细胞的标志。 胚胎干细胞特异性转录因子 ,其与 样均为体细胞重编程所必须的基因 ,除了可与 同调节维持细胞的多能性之外 ,还能促进干细胞向神经外胚层分化。 是 胞形成所必须的基因 ,其作用是提高克隆形成的效率 ,当同时将二者去除时 胞将不 能生成 胞 ,因此 胞产生的过程中同样重要。 在人类癌细胞中发现的卟啉 尽管 以提高 胞克隆形成率 ,但其构建的嵌合体小鼠约 20%发 3 生了肿瘤。所以如果将 胞用于临床治疗 , 因的转入必须慎重。是抑癌基因又是原癌基因 ,一方面可以促进 胞的自我更新 ,另一方面在体细胞中强制表达可抑制 阻滞细胞周期于 期 ,因此它在细胞增殖和分化之间起开关作用 2。 体细胞的选择 术虽然在不同物种的多种细胞上 都取得了成功，但是不同的受体细胞、不同的细胞状态及其传代代数，对于诱导的效率，甚至诱导是否能取得成功都有一定的影响。因此，在实验之初需准备符合要求的受体细胞。最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纤维细胞为受体细胞进行 导，虽然最终都得到了 胞，但是采用胎儿细胞进行的诱导效率明显要高一些。这可能是由于胎儿细胞增殖活力强，并且甲基化程度较低，易于重编程。随后，以小鼠肝脏细胞、胃表皮细胞、胰腺细胞，甚至成熟的 B 淋巴细胞作为受体细胞进行 导也都取得了成功，这充分说明了 术的普遍适用性，也 证明了各类体细胞都具有被重编程为多能性细胞的潜能。研究发现不同类型细胞来源的 胞具有不同的特点，如肝脏细胞和胃上皮细胞来源的 胞其基因组不易被病毒整合，具有较低的致瘤性，更适合于医学研究的需要。 也发现以角质细胞作为受体细胞可显著提高 诱导效率，并能降低病毒在受体细胞基因组上的整合。另外，神经干细胞本身表达较高的内源性 因子，当采用 个因子时，也能产生较高效率的 胞。因此，神经干细胞可以作为理想的受体细胞。不同受体细胞对于诱导效率的差异至今仍没 有确切的解释，但是从 导的过程可以认为，这可能是由于不同受体细胞间的表观遗传修饰的差异引起的。不同细胞基因组的甲基化和乙酰化程度各不相同，诱导重编程过程中开启外源基因表达的要求也不一样，如诱导过程中添加甲基化酶抑制剂可以明显提高诱导的效率。同时，有的受体细胞自身也表达部分的诱导因子，这不仅可以减少外源基因的使用数量，同时也减轻了重编程的负担，进而可以得到较高的 导效率，且减少诱导的时间，例如神经干细胞诱导为 胞。由于取材和培养简便，原代成纤维细胞仍然是导中最常用的受体细胞。 同时，为了确保受体细胞的增殖活力，尽可能使用低代数 (35 代 ) 的原代细胞进行诱导 3。 4 1.2 胞的表观遗传学 诱导得到的 胞以相应物种的 胞为参照标准，从分子、细胞和动物个体水平对其进行系统的检测。包括其多能性细胞特异的标志基因的表达情况，向 3 个胚层分化的潜能和自我更新能力，此外还涉及外源基因的沉默，及 确的遗传背景。 子水平上 胞中导入的外源基因表达水平要随着重编程的完成逐渐降低或沉默，内源的多能性基因表达激活，基因的选择以 胞表达的特 异性标志为参照。如通过 测 基因的表达情况且此类基因在不同物种间的表达不完全相同，如小鼠的 般 阳性， 阴性。而人的 胞则正好与之相反， 阴性， 阳性。此外，为了明确 胞的永生化能力，还需检测其端粒酶活性。 胞水平 多向分化潜能和体外自我更新的能力。所得到的 胞首先形态上要与 胞相类似，具体表现为细胞呈集落样生长、集落致密且边缘整齐、细胞形态较小、核质比高、增殖迅速、倍增时间短、能够长期传代。 胞经 色鉴定，要求呈阳性，还需进行多种转录因子及细胞表面标志的免疫荧光染色及流式细胞技术的分选，如： 。完全重编程的 胞应具有体外分化潜能，能够分化为各个胚层的不同类型的细胞，如外胚层的神经细胞、上皮细胞、软骨细胞等；中胚层的肌肉细胞、脂肪细胞等；内胚层的肝细胞、胰岛细胞等。此外，还需检测 胞 的核型情况，由于外源基因整合的随机性，使诱导得到的 胞会有较高比例的核型异常，那些核型异常的 胞，应予以剔除。 物水平 对 胞在免疫缺陷鼠 (如 鼠 ) 体内进行成瘤实验。将1 1065 106 胞注射到裸鼠的皮下，经过一段时间的生长，来观察皮下畸胎瘤形成的变化。根据动物来源的不同， 胞成瘤时间也不尽相同，如小鼠的 胞约在 1 个月左右能成瘤，但是猪的 胞需要 13 个月 5 时间才能成瘤。取出的瘤组织，经切片检测其是否发育 出 3 个胚层的各种组织。同时，在条件及伦理道德允许的情况下，还应将 胞在相应物种上进行嵌合体实验，要求后代能够真正生殖系嵌合。但与 胞类似，由于伦理道德等问题的限制，这一指标至今仍只在小鼠上获得成功。最近有研究报道，小鼠 胞通过与四倍体囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由胞发育而来的小鼠，这充分说明了 胞具有发育为完整个体的能力。 1.3 胞的发展及应用 成功建立 胞后，应用 胞来治疗疾病是人们的最终目标。 ，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。 胞的分化和移植在治疗血液疾病中的作用 胞诱导分化为内皮前体细胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝脏中，使病鼠出血不止的症状得到了有效地改善。 患病小鼠尾尖成纤维细胞重编程为 胞，然后通过同源重组的方法用人野生型蛋白基因替代了 蛋白基因，接着把遗传修饰后的 胞定向分化为造血祖细胞 (并将纯化后的 植入 性小鼠中，效地抑制了镰刀形红细胞贫血症症状。 获得了基因修饰后的贫血症患者特异性 胞，这些 胞能够分化形成表型正常的髓系和红系的造血祖细胞。中内启光等研究人员在培养 胞时，添加人类骨髓细胞以及促进细胞增殖的蛋白质等物质，结果 胞分化成了血小板的前身巨核细胞，巨核细胞进一步分化成血小板。从技术上来说，用 胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。红细胞体外培育的成功为人类研究通用红细胞提供了新的契机。研究组正在努力用一种 0 型 性个体体细胞重编程为 胞，进而对该 胞进 行体外定向诱导分化，培育出通用红细胞。 建立了一个从人 胞高效地分化成红细胞的系统。如果将该系统应用于患者特异性 胞上，就可获得无限量的患者自身的红细胞，这对于治疗一些血液疾病以及为罕见血型患者提供血细胞有着重要意义。 胞还可治疗神经系统疾病 6 将 胞分化为神经前体细胞，然后把这些细胞移植入胎鼠脑中，它们可整合到受体鼠的脑中， 13 5 d 后形成神经胶质细胞和神经元细胞，包括谷氨酰胺能神经元、 神经元、儿茶酚胺能神经元细胞。将由小鼠 胞在 体外诱导分化来的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠模型脑内，一段时间后可有效缓解大鼠疾病症状和改善其行为。最近，利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出 胞后，又成功将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞口。因此，其有望成为治疗帕金森症的一种方法。 胞也有望应用于治疗不孕症 将人 胞体外分化并分离得到原始生殖细胞 ( 基因表达上与体内分离的 为相似。如果能够进一步将这些 化为精子和卵子，就可帮助患者解决不孕问题。 供体外的疾病模型 提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。 和 分别建立了肌萎缩侧索硬化症 (脊髓性肌萎缩 (者特异性 胞。通过定向诱导分化，将患者特异性的 胞成功分化成了运动神经元。这些由患者来源的 胞分化等的运动神经元为人们提供了一个体外研究 病的系统。在研究清楚了 者运动神经元的致病机制后，还可在患者特异的 胞中通过遗传修饰来纠正基因缺陷，再分化得到功能正常 的运动神经元，以进行移植治疗。此外， 和 建立了多种遗传病患者特异性的 胞系，包括帕金森病、亨廷顿病、唐氏综合征三染色体 21 等。 成功地以人血液细胞为体细胞供体，诱导出了 胞，使得构建一些病症突变只局限于血液细胞的患者特异性 胞成为可能。利用从罕见神经系统疾病患者身上产生的干细胞，科学家们正在解析该种疾病的发病机制，并以此来测试若干候选药物的疗效。从家族性植物神经功能不全症 (有一个基因突变，该基因对蛋白进行编码，基因突变导致基因被转译成蛋 白时部分基因序列被跳过 )患者身上获取皮肤细胞，创建出 胞系，诱导为特定的细胞类型，如神经嵴细胞 (它能产生受 响的神经元 )。 7 这些细胞在分化成神经元的能力上是具有缺陷的，其并不像培养皿中的正常细胞一样容易迁移。研究人员利用此种差异来衡量 3 种药物的疗效，这几种药已被提议作为治疗 候选药物，其中一种药物就是激动素。这些患者特异性 胞令体外研究病变的人体组织的形成成为可能，从而有助于探索疾病形成机制以及研发特异性新药。这些研究成果还表明将来有可能为患者量身定做各种细胞，进行个性化治疗。但是由 于对于细胞 (包括 胞、 胞和成体干细胞 )自我更新与分化等行为的调控机制知之甚少，目前人们还不能按照自己的意图将干细胞在体外定向诱导分化为所需要的任何的功能细胞。随着人类对干细胞分化调控机制认识的不断加深，从人 胞将会衍生出更多种类的人类细胞，将为细胞替代治疗新药筛选与评价及其他用途提供大量的细胞。 术方面的障碍 经过了近 4 年既漫长又短暂的发展 , 胞技术已经取得了举世瞩目的进展。一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦 , 也带来了新的挑战 , 细胞重编程有望迎来一个新的研究 浪潮。尽管在 胞方面取得了如此大的成就，但是 胞的成功诱导比较复杂，诱导率比较低，科学家不依靠所谓的“基因搭载”也可以产生 胞， 4 种关键因子现在已作为蛋白质注射被应用。然而这种方法的效果还是很低，平均 1 万个普通细胞只有 1 个能变成 胞，少数获得的 胞还必须从细胞混合物中进行分离，整个过程至少需要 3 周至 4 周。因此诱导效率一直是科学界的难题，要想将 胞进行大规模生产就必须首先解决其诱导率问题。 来自不同国家的 5 个科研小组同时报告了相关进展，其中包括最先培育出胞的日本科学家山中伸弥的科研小组。科学家发现，通过阻断一个名为“ 的基因的路径，可以将皮肤细胞转化为 胞的成功率提高至 10左右，是原有转化率的大约百倍 。从而看出只要用合适的方法阻断 因（ 位于 17 号染色体短臂上 (长 16 20 11 个外显子组成，编码着393 个氨基酸组成的核磷酸蛋白，因其分子量为 53得名 。）的表达，就可大大提高 胞的转化 . 这样有针对性地使一定的 段开启或关闭是一个重要机制，可以控制体细胞不同的功能，并使每个细胞适用 序的 8 变化。但是 有抑制细胞癌变、阻止肿瘤生长的作用，因此在通过阻断“ 路径提高 胞转化率时， 肿瘤发生几率就会大大增加，因而，采用这种方法存在着很大的风险。而且阻断 因路径的方法复杂。 为了避免病毒和外源基因对得到的 胞产生的影响，研究者直接采用以上 4 个转录因子的蛋白质对受体细胞进行诱导。但是由于蛋白质在细胞内不 稳定，不能持续作用，因此需要对受体细胞进行多次的蛋白处理。 采用隔天多次将受体细胞与外源蛋白进行共培养的方法，通过特定的信号转导肽将其运送至受体细胞核内发挥作用，通过 4 轮蛋白因子的处理，再结合 辅助，才最终成功诱导得到 隆。而 则采用稳定表达四因子融合蛋白的 胞的裂解产物诱导人成纤维细胞，可最初连续 6 d 的诱导处理却引起受体细胞的死亡；随后通过 16 h 的蛋白诱导处理与新鲜培养液培养 6 d 相结合，进行反复 6 轮诱导之后才最终得到了 隆。蛋白质分子诱导 胞的效率极低，且所需时间很长。因此，这种方法可行性很低 3。 体细胞胞与 胞相比处于更高的甲基化状态。我们可以通过在转化过程中抑制体细胞的甲基化来提高的 胞的诱导效率。通过查阅文献了解到小分子化合物 2 5以抑制基因组的甲基化状态，提高其诱导率，且它们来源广泛、操作简单，为我们研究提高 胞诱导率提供充分的理论依据。 2、促进 胞诱导率的 小分子化合物 中文别名 :2,2正丙基乙酸 ,二丙基乙酸 , 4分子式： 子量 状： 无色液体 、 极微溶于水 、 相对密度 (沸点 221 、128 130 ( 折光率 (低毒，半数致死量 (大鼠，经口 )670mg/有腐蚀性。 其分子式如图 1 所示。 图 1 9 白色针状结晶，溶于水，在酸和碱中易水解 。其分子式如图 2 为 图 2 51210、 鼠淋巴细胞白血病和 均有明显抗肿瘤作用，是主要作用于 S 期周期特异性药。其抗肿 瘤作用与其他嘧啶类拮抗剂不同，与嘧啶核苷酸代谢并无关系，而是以伪代谢物身份替代胞嘧啶 掺入 扰 生理功能而产生细胞毒作用及抗肿瘤作用。近年来更注意到氮杂胞苷可 掺入 基化过程。许多基因的转录功能与嘧啶以甲基化状态密切相关，在整个细胞分裂过程中，通过甲基转移酶的作用，这种甲基化作用始终保持无缺，氮杂胞苷由于可 掺入 制 基化，因此影响基因的表达及分化 4。但是氮杂胞苷并不是影响所有基因的表达，而是对某些基因的表达有影响，对另外一些基因的表达则无影响 。 3 总结 本设计研究的价值 随着社会的发展，人们生活水平的的不断提高，人们对健康的重视程度越来越深入然而，面对许多疾病，科学家们也束手无策。这时 胞的出现让全世界人民脸上都露出了灿烂的笑容。 胞研究成果在干细胞和发育生物学研究领域中无疑具有里程碑意义，其在短时间内取得了一系列突破，可以预见，有朝一日， 胞必将应用于临床，解决人类面临的各种疾患等，获得安全、高效、实用、有临床应用价值的治疗型 胞。 胞的研究使我们无需毁灭胚胎就可以得到类 0 细胞，这样就回避了长期以来人们对人类胚胎使用 问题的伦理问题，为干细胞的研究、新药筛选及药物毒理研究和再生医学领域提供了新方法和新技术，并是以后获得患者自身遗传背景的胚胎干细胞的重要途径之一，也是研究人类疾病机理的重要方法之一，对将来的医学研究有着巨大的理论意义和实用价值。胞可能成为人类各种疾病细胞移植的一个资源，为人类疾病治疗带来了新的希望和契机，其研究的最终目的是应用于临床进行自体细胞治疗，现在很多人都非常期待 胞能尽早应用于多种疾病的临床治疗，如 1 型糖尿病、帕金森综合征、脊髓损伤及慢性肝病等。 目前， 胞的应用取得了令人瞩目的 进展。但是， 胞的诱导率很低，怎样提高 胞的诱导率是许多研究人员共同面临的问题。只有进一步阐明 胞产生的机制，成功地诱导出疾病特异性 胞，改善 胞的质量，提高诱导率，降低致瘤性，才能有助于推动 胞的临床应用向前发展。 本课程设计从 胞比 胞甲基化程度高着手，研究提高 胞诱导率的方法。通过从作用机制、药品来源、操作难易程度以及诱导后有无副作用几方面进行分析，选取了 2 5前暂无人使用此法研究 胞 诱导，希望本设计能 胞的高效率诱导提供一条可行性途径。 11 第二部分 课程设计部分 2 5胞诱导率的影响 胞的问世，将干细胞研究推进到了一个新的高度，极大丰富了干细胞的研究内容。它由体细胞导入外源转录因子重编程诱导而来，与 胞在功能、形态上基本一致。它除了生成胚胎以外，可以产生所有的细胞，如果用于医疗，理论上可以治愈所有疾病 凡是不好的组织都去除，替换为重新生长的正常组织。它避免了 胞所遇到的免疫排斥和伦理道德问题，因此可作为胚胎干细胞最好 的替代品用于科学研究和临床治疗，由于多潜能性干细胞的多向分化潜能和自我更新的特性 , 使其在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学研究、药理及毒理学等领域的研究中有着其独特的作用和优越性，使干细胞研究向前迈进了一大步 5。近几年， 胞像初升的太阳一样正在冉冉升起，在 胞方面研究的成果不断被公布出来包括体外疾病模型建立、药物筛选、细胞替代治疗等。在 胞的应用取得了令人瞩目的成就时，横跨在科学界的一大障碍却始终没有被排除，它就是 胞的诱导率问题。每万个细胞中只有一个可以被成功诱导，这给 胞的大规模生产带来了阻碍。体细胞比 胞处于更高的甲基化状态，在 胞有诱导的过程中加入小分子化合物 2 5接提高受体细胞被诱导的效率 3。目前 ,关于 胞诱导率研究的报道还很少。本设计把这两种物质联合来进行 胞诱导，尚属首例，填补了无人着重研究使用小分子化合物进行 胞诱导的空白。本实验设计在进行 胞诱导的培养 12 基中分别加入不同剂量的小分子化合物 2 5期通过实验得到 2 5胞苷以及二者的混合物对 胞诱导的影响，以寻求提高 胞诱导率的最佳途径。 1 材料 鼠 携带有 基因的小鼠，购自南京大学。不带转基因的小白鼠由本实验室提供。 胞株、质粒 细胞株、质粒 厂商 美国 国 国 国 c 国 E 细胞、 上海生命 科学研究院 试剂 厂商 染试剂 司 培养液 司 胰酶 司 非必需氨基酸 司 青霉素 /链霉素 司 司 司 司 胎牛血清 司 白血病抑制因子 司 上海源叶生物科技有限公司 碱性磷酸酶（ 上海如吉生物科技发展有限公 司 2国药集团化学试剂有限公司 5拓新集团 要器材 13 仪器 厂商 型号 高速台式低温离心机 德国 湿度 胞培养箱 美国 荧光显微镜 日本 600 6 孔板 北京耀北生物技术公司 自动数字天平 自动高压消毒锅 日本 方法 胞培养基的制备 养基的制备 按照 88%培养液， 10%胎牛血清， 1 %青霉素 /链霉素， 1%非必需氨基酸的量进行 混合，用 m 滤膜过滤后于 4 保存。 胞培养基的制备 按照 80%培养液， 15%胎牛血清， 1 % 1%非必需氨基酸， 1 % 1 %青霉素 /链霉素， 1% 1 000 血病抑制因子 的量进行混合，用 m 滤膜过滤后于 4 保存。 养层细胞的制备 制备 处死妊娠 13.5 d 的携带有 基因的母鼠，用无菌手术器械剖腹取出胚胎，用 洗。去除胚胎的头部、尾部、内脏及四肢。躯干部分用 洗干净。将组织块剪碎，移入 50 心管中，加入 胰酶于 37 消化 20 到出现大量单细胞，加入 养基终止，吹打后制成细胞悬液。将细胞悬液转入 100 养皿中，补加适量 养基。来回晃动培养皿后，置于 37 细胞培养箱培养。待细胞长满时将其冻存。 养层细胞的制备 养层细胞的制备处理方法大致同 是所用的小白鼠并非为转基因鼠。 射线照射灭活后作为饲养层细 胞使用。 导产生 胞 14 将质粒 ( c 分别通过 染试剂 转染 E 细胞，次日换液，并于 48 h 后收取逆转录病毒液，经 m 滤膜过滤后待用，对应的 5 种病毒液分别记为 G， O， S， K， M。 O， S， K， M 以 1 1 1 1 比例感染 感染后第 4 天，将细胞用胰酶消化，计数后将其铺至培养有养层细胞的 6 孔板，密度为每孔 5 104 个细胞 。 至饲养层细胞上之后每天更换 养基。分别在感染后第 12 天和第 16 天对 胞诱导效率检测。 2.4 胞诱导率的测定 染病毒后第 12 天， 6 孔板用于碱性磷酸酶染色( 色 )， 性克隆比率越高， 性细胞比例越高，则表示胞诱导效率越高。据 色结果，将 性克隆的个数除以原始接种的 胞数目，可以得到的 性克隆比率即为 胞系的鉴定 从诱导产生的 隆中选取 性克隆进行扩大培养，建立起 胞系，并对 胞系进行鉴定。鉴定主要包括如下两个方面 : (1)用荧光显微镜检测 胞系的 达情况 ; ( 2) 用碱性磷酸酶染色检测 胞系是否处于未分化状态。 色荧光蛋白表达检测 用荧光显微镜对所建立的 胞系进行 达检测。诱导后的 明它可以长期保持未分化状态。此外，这些 胞呈克隆状生长，克隆内部 细胞均质，单个细胞核质比高，克隆形态和胚胎干细胞相似。 性磷酸酶染色鉴定 碱性磷酸酶染色鉴定小鼠 胞和 胞都表达碱性磷酸酶 ( 的活性，除牛的 胞不表达 活性外，其它动物和人的 胞都表达 15 活性，分化的 胞不表达，所以 活性可作为鉴定 胞是否分化的一个标志。本文采用 色法对 胞系 1 进行鉴定，结果显示几乎整个 落都呈现很强的碱性磷酸酶活性，具备 胞的多能性特征，证明 1 处 于未分化状态。 3 设计 胞苷 对 胞诱导率的影响 将细胞用胰酶消化，计数后将其铺至培养有 养层细胞的 6 孔板中，在其中五孔中分别加入 分子化合物5第六个孔不加如小分子化合物，用来做对照。诱导完之后，分别计算出每个孔中 胞的转化率。从而得出 5 胞诱导率最高时的剂量，判断它的影响程度。 胞诱导率的影响 将细胞用胰酶消化，计数后将其铺至培养有 养层细胞的 6 孔板中，在其中五孔中分别加入 分子化合物 2第六个孔不加如小分子化合物，用来做对照。诱导完之后，分别计算出每个孔中 胞的转化率。从而得出 2 胞诱导率最高时的剂量，判断它的影响大小。 5 胞苷 共同对 胞诱导率的影响 将细胞用胰酶消化，计数后将其铺至培养有 养层细胞的 6 孔板中，在其中五孔中分别以 1:1、 1:2、 2:1、 3:1 小分子化合物 25 胞苷 的混合物，经过培 养诱导，分别计算出分别计算出每个孔中 胞的转化率。从而显示出 2 5怎样比例混合对 胞诱导率的影响最大。 4 分析与总结 胞诱导率的影响 5掺入 基化过程。许多基因的 16 转录功能与嘧啶以甲基化状态密切相关，在整个细胞分裂过程中，通过甲基转移酶的作用，这种甲基化作用始终保持无缺，氮杂胞苷由于可掺入 制 基化，因此影响基因的表达及分化。而体细胞与 胞的区别之处正在于，体细胞具有高的甲基化状态，而不能表 现 胞的多能分化的特点，能得出 5胞的诱导率。本设计中 5基化的功能，设计不同的剂量对 胞的诱导率的影响， 定出 胞的转化率，并通过碱性磷酸酶染色鉴定 、绿色荧光蛋白表达检测对 胞系进行纯度鉴定。从而判断出最适的剂量。 胞诱导率的影响 2胞的诱导率，其作用机理可能也是抑制 还不是很明确。本设计通过与 比能得出 25适剂量时，哪种物质对 胞的诱导率贡献更大。 5胞诱导率的影响 25胞的诱导率，把他们掺在一起诱导 胞生成。诱导完成之后， 定出 胞的转化率，并通过碱性磷酸酶染色鉴定 、绿色荧光蛋白表达检测对 胞系进行纯度鉴定，从而判断出他们能否具有协同作用。以寻求出诱导小鼠成纤维细胞转化为 本设计通过 种小分子分别在最适剂量时诱导小鼠成纤维细胞转化为 胞的诱导率，从而判断在诱导 胞时，哪种小分子作用更有效。通过 以的得到它们掺在一起诱导的效率。通过这三组实验的对比，得到 25胞的诱导率高，以及共同作用时对 胞的诱导效率高。从而，为提高 胞的诱导率提供可行性方案。 5 课程设计心得 本次课程设计我的题目定位 2 5胞诱导率的影响。我们进行了三周的课设，这段时间里我们紧张的为 它忙碌着。但是， 17 收获了很多，很充实。 首先，在设计之初我脑中的初步模型是研究器官、组织再生。通过查阅很多的文献资料，我对 胞产生了极大地兴趣。 胞因其生物学、医学等方面广泛的应用前景在诱导成功后只有四年的时间里，各项成果不断被推起。从而也证明的它的价值。因此，我决定着手于 胞的研究。通过大量的阅读关于 胞的文献，发现了一个重要的问题。尽管 胞已经取得了许多令人瞩目的成就，而且有很广阔的应用前景。但是，它的诱导率确是科学界的一大障碍。因而，我选择了对其 胞诱导率的研究。在反 复的查看文献之后，发现了 2 5 胞苷 这两种小分子化合物可以对 胞的成功诱导起促进作用。经过与同学们的探讨把题目定了下来。 然后，在设计过程中遇到了很多问题，由于 胞研究的时间按短，所以有关这方面的文献很少，而关于其诱导率的文献更少。但是，通过深入的思考以及与同学们的共同研究，确定了整体设计思路。在书写论文的过程中出现了很多细微的错误，比如：格式、字体等等。经过几遍的再查以及同学复查之后，形成了最后的论文。 最后，在课设的过程中，我学到了很多：将