第二章质粒dna的微量提取sds法

实验二质粒 DNA的微量提取碱裂解法 （ SDS法）一 .目的与要求通过质粒的一些基本特性、质粒 DNA的提取技术，学习用碱变性法提取质粒 DNA的方法。二 .相关知识质粒 (Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是一种环状的双链 DNA分子。广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从 1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。 质粒 DNA的存在区域和结构特征电镜中质粒 DNA的形态 严谨型： 质粒的复制受到寄主细胞 严格 控制，与寄主细胞的复制偶联同步。因此，在一个细胞中只有 1个或几个 拷贝； 松驰型： 质粒的复制是在寄主细胞的 松弛 控制之下的，每个细胞中含有 10-200个 拷贝。用一定的药物处理，抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至 几千份 。 质粒 pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：载体 (Vector)：用于携带 重组 DNA，并且能够使外源 DNA一起复制或表达的质粒 (运载工具 )。具备的条件 :1.具备条件（ 1） 易于鉴定；（ 2）在受体细胞中可以独立复制；（ 3）易于筛选；（ 4）易于导入受体细胞。2.结构 特征(1)抗性基因 （ Ampicillin gene, Kanamycine gene)(2)启始复制子 （ ori)；(3)多克隆位点 (MSC)；(4)标记基因 (LacZ gene)。InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA 是具有一定结构的物质，特殊的环境会导致 DNA的变性，如加热、极端 pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使 DNA复性。三 .原理：SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以 SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组 DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的 DNA遇到强碱性（ NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液，使溶液处于中性，质粒 DNA将迅速复性，而基因组 DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒 DNA将在上清中，而基因组 DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。四 .细菌裂解的方法：(1)碱裂解法 ： 0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法 :沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法 ： 10%SDS, 用于质粒大量提取。五 .DNA浓度的测定：(1)分光光度计法 :碱基 (G,A,T,C）在 260nm处具有强吸收峰，一般在中性 pH值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。(2)荧光的强度法：(3)凝胶电泳比对法，与标准分子量相比较。六 . 材料和仪器1.材料 :含有 质粒 P3.5K-EGFP的大肠杆菌 DH5 。 P3.5K-EGFP是一种酵母荧光表达载体，常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。2.试剂：裂解 液一， 裂解液二，裂解液三，酚氯仿，异丙醇， 70%乙醇，TE等。3.仪器设备：高速离心 机，移液器，摇床等4.加入 400l新配制的裂解液二，加盖颠倒 6-7次使之混匀，放置 3-5min（不得超过 5min） ;七 .质粒微量提取的方法培养细菌收集菌体悬浮菌体裂解菌体1.将带有质粒的 DH5a接种到 3-5ml含有 amp抗生素的液体培养基， 37 培养 12-16h;2.取液体培养液 1.4ml于 Ep管中， 10000rpm离心1min，去掉上清液，重复步骤 2； 最后瞬时离心后，用移液器去除上清。 （所有去除残液均用此法）3.加入 200l裂解液一，涡旋混匀放置 5min;5.加入 300 L裂解液三 (乙酸钾溶液 )，加盖后颠倒 6-7次混匀，放置 3-5min;中和复性6.用台式高速离心机， 12000rpm离心 10min。离心除杂12.将分离出的质粒 DNA置于 -20 保存备用。9.沉淀用 0.5mL70乙醇清洗一次， 12000rpm离心5min，弃上清，重复 9；11.加入 20-30l含有 20g/ml RNase的 ddH2O或 TE 溶解，室温放置 15-30min，使 DNA充分溶解 .去蛋白沉淀洗涤7.将 700 L上清移入另一干净离心管，加入等体积的酚、氯仿（ 700ul）， 12000rpm离心 10min。10.瞬时离心，用移液器将管底残余液体移除，小管倒置于吸水纸上，室温自然干燥至透明 ;样品干燥样品溶解样品保存8.取 600 L上清到另一离心管中，加入等体积冰冻异丙醇， 混匀， 12000r/min离心 5min，弃上清 ;离心收集(1)取 2l提取的质粒 DNA，加入 98L蒸馏水 对待测 DNA样品做 1:50(或更高倍数的稀释 );(2)蒸馏水作为空白 ,在波长 260nm、 280nm处调节紫外分光光度计读数至零。(3)加入 DNA稀释液，测定 260nm 及 280nm的吸收值，并记录。(4) 通过计算确定 DNA浓度或纯度，浓度单位为 g /ml,dsDNA=50(OD260) 稀释倍数补充内容 1. 用分光光度计法定量 DNA260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为 1相当于约 50g /ml双链 DNA， 33g /ml单链。可根据在 260nm以及在 280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般 DNA的纯品，其比值为 1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。补充内容 2. 凝胶电泳检测 DNA的浓度实验步骤实验步骤见下一个试验 琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法 结果1%的琼脂糖凝胶， 90V,40分钟。NEB 标准分子量片段 (1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder虽然不能对 DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。片段 碱基对 质量1 10,002 42 ng2 8,001 42 ng3 6,001 50 ng4 5,001 42 ng5 4,001 33 ng6 3,001 125 ng7 2,000 48 ng8 1,500