抗生素发酵生产工艺学

抗 生 素 发 酵 生 产 技 术Antibiotics Fermentation Production1 概述 生产前期研究 生产菌改良 生产工艺过程 发酵条件的控制 提取和精制 Introduction Research in Lab Strain improvement Production processing Fermentation control Isolation & purification 抗 生 素 发 酵 生 产 技 术Antibiotics Fermentation Production2抗生素是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地 抑制或杀灭 其他微生物或肿瘤细胞的 有机物 。 Antibiotics Any organic substances produced by various organisms that have the power of arresting the growth of other microorganisms or of destroying them.1. 概 述 Introduction3历史 1929年，英国弗莱明发现青霉素 二战期间，大规模发酵生产 世界上最早用于临床的抗菌素 History Penicillin was discovered by Fleming in 1929. World War II, fermented in large-scale The first major antibiotic to be commercialized1. 概 述 Introduction4根据抗生素的作用机制分类 (Modes of Action of Antibiotics) 抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis) ： 青霉素 抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage) ： 多烯类抗生素 抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis) ： 四环素 抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis) ： 丝裂霉素分 类 Classification1. 概 述 Introduction5复制翻译转录6根据抗生素的化学结构分类 -内酰胺类 (-lactam)： 青霉素类 (penicillins) 头孢菌素类 (cephalosporins) 氨基糖苷类 (aminoglycosides) ： 链霉素、庆大霉素 大环内酯类 (macrolides) ： 红霉素、麦迪加霉素 四 环 类 (tetracyclines) ： 四环素、土霉素 多 肽 类 (polymyxin) ： 多粘菌素分 类 Classification1. 概 述 Introduction7HNO NS CH3CH3HCOO-H-lactam ring -内酰胺 环Rnatural penicillin R = CH2-CO-8-内酰胺 环9两性霉素Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system10 产生菌的筛选 抗菌性试验 提取、精制、鉴定 毒性试验 药理和临床试验 Screening of a strain Antimicrobial trial Isolation, purification and identification Toxicological trial Medicinal & clinical trial 2 生产前期研究Research in Lab11Agar diffusion assayagar plate琼脂培养基lawn of test bacteria测 试 菌 苔filter papers soakedwith test compounds含 药 物 滤 纸zones of inhibition(no growth) 抑菌圈12分 析 仪 器Analytical instruments现代分析仪器： 核磁共振 毛细管电泳 气相色谱 高效液相色谱 质谱Modern analytical instruments: Nuclear magnetic resonance (NMR) Capillary electrophoresis (CE) Gas chromatography (GC) High performance liquid chromatography (HPLC) Mass spectroscopy (MS) Automation Sensitivity Accuracy自 动 灵 敏 准 确13人工诱变法：紫外线 、 X-线、 r-线照射亚硝基胍 、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理Conventional strain selection Physical mutageneg. Ultraviolet Radiation Chemical mutagen eg. Nitrosoguanidine (NTG) Improved strain can be selected empirically3. 抗生素 生产菌改良Strain Improvement14基因工程Genetic Engineering3. 抗生素 生产菌改良Strain Improvement Recombinant DNA Technology （ DNA重组技术 ）克隆15Strain Improvement Scale-upStrain出发菌株Agar plate平板技术Primaryshake flaskEvaluation摇瓶培养Secondary shake flask evaluationdifferent media二级摇瓶培养各种培养基Lab fermentor evaluationProductionCondition小型发酵罐模拟生产条件Mastercell bankWorkingcell bankInoculumDevelopment菌种扩大培养Pilot plantEvaluation中试生产ProductionEvaluation生产6000300 3031Possiblerecycle1617Scale-up（ 比拟放大）models EL Gadden Jr200 m3 Same productivity ? Limitations ?模 拟18摇 瓶 发 酵 Shake-flask fermentation 10-50 ml in 125-500 ml flask Batch only Limited control: temperature Slow metabolizing carbohydrate Ambient pressure Buffers needed to control pH In-process sampling difficult Volume decrease by evaporation Solid growth on side walls Antifoam not needed Agitation limited: shaker speed No control of dissolved oxygen 装液量： 10% (250ml) 间歇培养 温控受限制 代谢碳水化合物慢 常压 缓冲液控制 pH 在线取样难 容量减少 瓶壁上结垢 无需消泡 搅拌 受限制 无法控制溶解氧 19搅 拌 罐 发 酵 Stirred tank fermentation 10-100,000升容量 间歇和补料培养 连续控制： pH， 温度 需要铵盐或氨气 2 大气压 无需 缓冲液 在线取样易 补料 ,容量增加 生长均匀一致 需消泡 多种搅拌 控制溶解氧 :通气 ,加压 10-100,000 liter vessels Batch and feed possible Continuous control: pH, temperature Ammonium salts or ammonia needed Pressure at two atmospheres possible No buffers necessary In-process sampling easy Volume increase by sugar feed Very uniform growth Antifoam often required Wide variety of impellers and baffles Dissolved oxygen controlled by aeration, pressure 20摇 瓶 发 酵 Shake-flask 装液量： 10% (250ml) 间歇培养 温控受限制 代谢碳水化合物慢 常压 缓冲液控制 pH 在线取样难 容量减少 瓶壁上结垢 无需消泡 搅拌 受限制 无法控制溶解氧 10-100,000升容量 间歇和补料培养 连续控制： pH， 温度 需要铵盐或氨气 2 大气压 无需 缓冲液 在线取样易 补料 ,容量增加 生长均匀一致 需消泡 多种搅拌 控制溶解氧 :通气 ,加压搅 拌 罐 发 酵 Stirred tank 21菌种 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品包装Strain Preparation of seed Fermentation Treatment of broth Isolation & purification Package of product4. 抗生素生产工艺过程Antibiotics Production Processing22A scheme of the material flow in an antibiotic production 23A scheme of the material flow in an antibiotic production 连消发酵罐缓冲罐种子罐24发酵生产原料 Materials for FermentationCarbon source: Beet & cane molasses Glucose, lactose, starch Ethanol, methanol Glycerol Maltose syrup, corn syrup Cottonseed oil, peanut oil, soy oil Lard oil Methyl oleate Tallow碳源 : 甜菜和甘蔗糖蜜 葡萄糖，乳糖，淀粉 乙醇，甲醇 甘油 麦芽糖浆，玉米糖浆 绵 籽 油，花生油，豆油 猪油 油酸甲酯 油脂25氮源 : 绵 籽 粉 玉米粉和玉米浸出液 大豆粉和大豆面 花生粉 菜籽粉 牛血，酪蛋白水解液 乳清 鱼粉 酵母 酵母膏 肉粉和骨粉 Nitrogen source: Cotton seed meal Corn meal & steep liquor Soybean meal & flour Peanut meal Rapeseed meal Beef blood, Casein hydrolysate Whey Fish meal Whole yeast Yeast extract Meat & bone meal发酵生产原料 Materials for Fermentation26培 养 基 Media for Cell Growth & Final productionComponents Range %组 成Glucose/ sucrose 3.0-5.0葡萄糖 / 蔗糖Starch 淀粉 3.0-5.0Corn steep liquor 3.0-5.0Calcium carbonate 0.5-1.0碳酸钙Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5Ammonium sulphate 0.1-1.0硫酸胺Urea 尿素 0.1-0.5Oil 油 0.1-0.5Fermentation 发酵培养基Components Range %组 成Glucose 0.5-1.0Starch 0.5-5.0Corn steep liquor 5.0-8.0玉米浸提液Soy flour 1.0-5.0Phosphate 0.1-1.0Ammonium sulphate 0.5-1.0and fed periodicallyOil 1.0 and fed continuouslyCorn syrup fed continuously玉米糖浆 连续加料Tank seed 种子培养基27Stirred tank Fermentation 搅拌发酵285. 发 酵 控 制 Fermentation Co