天津医科大学抗体纯化与鉴定技术-09

抗体纯化与鉴定技术临床免疫学教研室李会强 教授1抗体纯化的目的 去除： 杂抗体（交叉反应抗体） 杂蛋白（提纯 IgG及其片段）2盐析法粗提丙种球蛋白方法一 :3实验原理： 蛋白质溶解度在一定范围内随盐的浓度变化而变化。在低盐浓度下溶解度随盐的浓度升高而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。4实验原理： 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。5实验原理： 同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 6主要试剂： 饱和硫酸铵溶液 温度系数小，溶解度大（ 767 g/L） 不同饱和度析出蛋白质会依次析出； 价格便宜； 不容易引起蛋白质变性；7主要试剂： 饱和硫酸铵溶液 硫酸铵 800g850g溶于 1000ml H2O加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以 28NH4OH调 pH至 7.0。 0.01Mol/L pH7.4 PB 8操作： 技术路线分离血清等倍稀释50%饱和硫酸铵沉淀留沉淀33%饱和硫酸铵沉淀留沉淀9操作： 注意事项 硫酸铵的质量 饱和硫酸铵溶液配制 蛋白质浓度 盐析过程 脱盐10操作：透析除盐11葡萄球菌蛋白 A亲和层析提取 IgG方法二 :12实验原理： 蛋白 A（ Protein A ）或蛋白 G（ Protein G ）是细菌胞壁蛋白，它们能结合抗体 Fc段。天然 Protein G具有 3个IgG结合域， 天然的 Protein A具有 5个IgG结合域。这一结合非常牢固，但其亲和力对 pH的变化敏感，抗体 /蛋白 A或蛋白 G的亲和力随 pH的降低而急剧降低。13实验原理： 对于哺乳动物 IgG,Protein A比 Protein G具有更大的亲和力 ,尤其是对于 IgG的一些亚类 ,包括人类的 IgG3、小鼠的 IgG1即达鼠的 IgG2a. 14实验原理：15主要试剂： 层析载体 共价结合有蛋白 A或蛋白 G的树脂 琼脂糖微球 聚丙烯酰胺微球 性质稳定，价格低廉16主要试剂： 平衡缓冲液 0.01Mol/L pH7.4 PB 洗脱缓冲液 柠檬酸缓冲液 pH=3 柠檬酸缓冲液 pH=617主要试剂： 中和缓冲液 氨基丁三醇 -氯化钠 pH=3 pH=618操作： 装柱 平衡 pH7.4 PB pH3 洗脱缓冲液 pH8.9 结合缓冲液 pH6 洗脱缓冲液 pH3 洗脱缓冲液19操作：20注意问题：21DEAE离子交换层析提取 IgG方法三 :22实验原理： DEAE-Sephadex A-50 阴离子交换树脂能吸附阳离子； 血清中的 -球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在 pH7.2 7.4的环境中 , 酸性蛋白被 DEAE-Sephadex A-50吸附， -球蛋白不被吸附而得以纯化。23操作： 装柱 平衡 pH7.2 PB 上样 收集24操作：25抗体特异性纯化方法四 :26去除交叉反应抗体，提高免疫血清特异性免疫亲和层析是去除交叉反应