免疫组化显色系统

免疫组化显色系统Visualization Systems ofImmunohistochemistry (IHC)免疫组化技术原理 用 标记物或显色物标记抗体或抗原 通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分 免疫组化染色是一项综合性技术 组织材料的准备 免疫组化染色前处理 免疫组化染色 (一抗 , 显色系统 )免疫组化原理图标注解一抗 1一抗 2抗兔 二抗抗鼠二抗组织抗原 1抗原 2过氧化物酶碱性磷酸酶双染 阻断剂显色剂 (棕色 )显色剂 (红色 )葡聚糖骨架分子回顾过去直接法 二步 间接法 三步 间接法 酶 免疫复合物法 链 亲和素 -生物素法 (ABC)目前常用的显色系统 一步法 : EPOS ( Enhanced Polymer One-Step Staining) 二步 法 : EnVision Systems 双染 : General Doublestain 三步法 : LSAB (Labeled Sstreptavidin-biotin) 催化放大系统 :CSA (Catalyzed Signal Amplication System) 动物研究试剂盒 : ARK (Animal Research Kit)一步法 EPOS 原理 : 在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶 .即一抗上已标记过氧化物酶 . 这种一抗与抗原结合后即可直接显色 .多聚骨架分子特异性一抗组织抗原过氧化物酶一步法 EPOS 主要实验流程组织片脱蜡 ,水化 阻断(S2001)TBS冲洗 (S1968)一抗 /HRP(U) TBS冲洗 (S1968)显色剂 DAB或 AEC(K3467或 K0697) 水 漂洗素木精 复染 (S3309)一步法 EPOS特点 : 一抗孵育后直接显色 即用型试剂 快速 (一步 )完成 敏感性较差 昂贵 使用对象 : 要求快速出结果的免疫组化实验对象二步法 EnVision 原理 : 在葡聚糖大分子上标记二抗及酶 , 将传统的二抗和三抗 (酶 )连接在一起 ,形成一个复合物 EnVision. 两步孵育完成免疫组化 .二步法 EnVision 原理图一抗与抗原结合 EnVision二抗复合物与一抗结合二步法 EnVision 主要实验流程阻断内过氧化酶 (S2001) TBS冲洗 (S1968) 一抗孵育 (Mo . Rb.)EnVision(Mo.K4001 Rb.K4003) TBS冲洗 (S1968) 显色剂 DAB或 AEC(K3467或 K0697)苏木精复染 (S3309)TBS冲洗 (S1968) 二步法 EnVision特点 : 二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂 (避开了传统的生物素与链亲和素结合 ), 不受内源性生物素干扰 . 即用 ,方便 ,快速 (两步 ). 敏感性强 . 背景低 . 是目前最理想的免疫组化显色系统 使用对象 可向所有做免疫组化的用户推荐 .EnVision二步法双染原理 : 与 EnVision二步法原理相同 , 只是为达到在同一组织上标记两种抗原 . 必需用两种动物来源的一抗 (常用抗小鼠和兔 ),分别配相应的 EnVision(二抗 ) , 再用两种颜色的显色剂显色 .EnVision二步法双染 原理图鼠一抗接抗原 1 鼠 EnV/HRP接 抗鼠一抗 DAB(显色剂 1) 双染阻断剂兔 一抗接抗原 2 兔 EnV/AP接抗兔一抗 Fast Red(显色剂 2)EnVision二步法双染 主要实验流程阻断内过氧化酶 (S2001) TBS冲洗 (S1968) 一抗 (1 Mo.)孵育TBS冲洗 (S1968) EnVision/HRP( 1 Mo.) TBS冲洗 (S1968)显色剂 1 DAB(K3467) 蒸馏水冲洗 双染阻断剂 (Kit含 )一抗 (2 Rb.)孵育 TBS冲洗 (S1968) EnVision/AP( 2 Rb.)TBS冲洗 (S1968) 显色剂 2Fast Read(K0597) 蒸馏水冲洗苏木精复染 (S3309)EnVision二步法双染特点 : 即用 ,方便 ,快速 ,省时 . 敏感性强 . 背景低 . 在同一组织切片上 , 用两种不同标记物标记两种不同的抗原 .使用对象 需在同一张切片上标记两种抗原者主要是形态学科研人员三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)原理 :应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标记链亲和素 (Streptavidin)的亲和作用 , 连接一抗及抗原 , 形成大分子 .再通过相应酶的底物 (显色剂 )作用使之显色 .三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)原理图 :一抗与抗原结合 二抗 /Bio与一抗结合 STPA/HRP(AP)与二抗 /Bio结合三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin) 主要实验流程阻断内过氧 (S2001) TBS冲洗 (S1968) 一抗孵育 (Mo . Rb.)TBS冲洗 (S1968) TBS冲洗 (S1968)二抗 /生物素 (Mo.E354 Rb.E353) TBS冲洗 (S1968)显色剂 DAB或 AEC(K3467或 K0697)Fast Read(K0597或 K0699) 苏木精复染 (S3309)链 亲和素 /HRP或 AP蒸馏水冲洗三步法 LSAB (Labeled Streptavidin-biotin)特点 : 便宜 有现成的兔 , 鼠 , 羊通用试剂盒 会有内源性生物素造成的非特异性背景使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐 .催化放大系统 CSA (Catalyzed Signal Amplication System)原理在经典三步法免疫组化放大基础上 ,通过生物素化酪胺的催化 ,将又一次加入的酶标记链亲和素(Streptavidin-enzyme) 与二抗中生物素亲和 ,使已放大的分子再一次放大 .催化放大系统 CSA (Catalyzed Signal Amplication System) 原理图一抗与抗原结合 二抗 /Bio与一抗结合 STAV/Bio与二抗 /Bio结合 放大液催化 加入 STAV/HRP与 Bio再结合催化放大系统 CSA (Catalyzed Signal Amplication System)主要实验流程 :阻断内过氧 (S2001)水洗TBS冲洗 (S1968)二抗孵育 (Rb a-Mo/Bio)TBS冲洗 (S1968) 放大液 (Kit含 )链亲和素 /生物素 Strep./Bio (Kit含 ) TBS冲洗 (S1968) 显色剂 DAB或 AEC(Kit含 )苏木精复染 (S3309)链 亲和素 /过氧化物酶 Strep./HRP(Kit含 )蒸馏水冲洗蛋白阻断剂 (Kit含 )一抗孵育 (Mo) TBS冲洗 (S1968)TBS冲洗 (S1968)TBS冲洗 (S1968)催化放大系统 CSA (Catalyzed Signal Amplication System)特点 : 敏感性极强 实验步骤较多 较贵使用对象 : 需做免疫组化实验者 , 特别适用于某些石蜡片不易出结果的一抗 .动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit) 原理在一抗与组织抗原反应之前 : 小鼠一抗F(c)与生物素化抗小鼠 F(ab)片断结合 ,再加入小鼠免疫球蛋白 , 中和未被结合的生物素化抗小鼠 F(ab). 用该复合物再与小鼠组织中特异抗原反应 , 可降低非特异性背景 . 动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit) 原理图小鼠一抗 抗 小鼠 IgF(ab)/Bio免疫复合物 /Bio和游离抗小鼠 Ig F(ab)/Bio免疫复合物 /Bio和游离抗小鼠 Ig F(ab)/Bio小鼠 Ig 免疫复合物 /Bio和被中和的抗小鼠 Ig F(ab)/Bio与组织抗原结合按 LSAB法 继续免疫组化染色动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit) 主要实验步骤 一抗与组织抗原反应之前需做试剂的预处理 :小鼠一抗 + 抗小鼠 Ig的 F(ab)/Bio 复合物 1复合物 1 + 小鼠 Ig 复合物 2 (已优化的一抗 )用 复合物 2作为一抗同 LSAB三步法免疫组化染色动物研究试剂盒 ARK (Animal Research Kit) 特点小鼠一抗在小鼠组织切片上做免疫组化可降低背景 . 使用对象需用小鼠一抗做小鼠组织的免疫组化实验者