代谢组学-许国旺

代谢组学 -方法与应用 授课教师 ：吴敬 教授授课时间： 2009年 11月1江南大学“基因组学反映了什么是可以发生的，转录组学反映的是将要发生的，蛋白质组学指出了赖以发生的，只有代谢组学才真正反映业已发生的。 ” 许国旺2江南大学第一章 代谢组学的简介 第二章 代谢组学的研究方法第四章 代谢组学的应用第五章 代谢组学的发展前景 3江南大学组学时代 4种最重要的组学4江南大学代谢组学 （ Metabonomics/ Metabolomics ）是通过考察生物体系（细胞、组织 或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。代谢组 （ metabolome）是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常生长功能 和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子量小于1000的内源性小分子。代谢物数量因物种不同而差异较大：植物（ 200 000种）、动物（ 2500种）、微生物（ 1500种）5江南大学代谢组学是继 基因组学 和 蛋白质组学 之后新近发展起来的一门 学科 ，是 系统生物学 的重要组成部分。基因组学和蛋白质组学分别从 基因 和 蛋白质 层面探寻 生命 的活动，而实际上 细胞 内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放（ cell signaling），能量传递，细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组（ metabolome） 在某一时刻细胞内所有代谢物的集合 的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连，而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境，这又与细胞的营养状态，药物和环境污染物的作用，以及其它外界因素的影响密切相关。因此有人认为， “ 基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。” （ Bill Lasley, UC Davis）6江南大学198219831984198919992000200120022004Van De Greef: publication of MS for urine profilingSadler, Buckingham and Nicholson: First publication on 1H-NMR of blood and plasmaNicholson, et al.: Multi-component analysis of spectra data from rat urineNicholson and Wilson: NMR spectroscopy of biofluidsNicholson: Definition of MetabonomicsHaselden, et al.: First independent Pharma publication of Metabonomics Nicholson, Lindon, and Holmes: Publication in Nature on MetabonomicsHolmes and Antti Explanation of statistics in Metabonomics Increasing # of publications第一章 代谢组学简介 代谢组学的发展7江南大学代谢组学的特点：1.关注内源化合物2.对生物体系的小分子化合物进行定量定性研究3.上述化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响4.上述内源性化合物的知识可以被用于疾病的诊断和药物筛选与转录组学和蛋白组学相比，代谢组学有以下优点：1.基因与蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易2.代谢组学的研究不需要建立全基因测序及大量序列标签（ EST）的数据库3.代谢物的研究种类远小于蛋白质的数目4.研究中采用的技术更通用8江南大学 Genomics and Proteomics are not sufficient to describe reasons for toxicity or disease state基因组学和蛋白组学对于毒性或疾病状态的描述是不足的 Neither Genomics nor Proteomics can produce time course information which is important for animal to animal comparison基因组学和蛋白组学都不能提供动态信息，但这些信息对于动物间的比较是重要的 Metabolite profiling produces information on the biochemical pathways effected代谢物分析能提供生化途径结果的信息 Monitoring metabolites allows concurrent or sequential affects to be monitored, e.g. blocking of a metabolic pathway in the liver can lead to toxicity in the brain (hydrazine)代谢监控可监控即时或相继的结果，例如：阻断肝脏中代谢途径会在脑中产生毒性肼 Metabonomics, unlike the other “omics” is non-invasive不像别的组学研究，代谢组学是无创的The Need for Metabonomic Information9江南大学代谢组学研究现状代谢组学属于 全局系统生物学（ Global systems biology） 研究方法，便于对复杂体系的整体进行认识譬如，一个正常工作的人体包括 “ 人体 ” 本身和与之共同进化而来且共生的消化道微生物群体（或称菌群），孤立地研究 “ 人体 ” 本身的基因，转录子以及蛋白质当然可以为人们认识人体生物学提供重要信息，但无法提供使人体正常工作不可缺少的菌群的信息人体血液和尿液的代谢组却携带着包括菌群在内的每一个细胞的信息，因此代谢组学方法对研究如人体这样复杂的进化杂合体十分有效10江南大学不同器官 组织 具有不同的代 谢轮 廓，广 谱 全采集11江南大学代谢组学已经广泛地应用到了包括药物研发 ,分子生理学 ,分子病理学 ,基因功能组学 ,营养学 ,环境科学等重要 领域 .在代谢组学诞生后的 6年里 ,有关代谢组学的研究论文和专利以指数的形式逐年增长 .12江南大学代谢组学与系统生物学系统生物学概念的诞生 标志 着研究哲学由 “还原论 “向 “整体论 “的变化 .系统生物学的中心任务就是要针对生物系统整体 (无论它是生物细胞 ,多细胞组织 ,器官还是生物整体),建立定量 ,普适 ,整体和可预测 (QUIP)的认知 .具体而言 ,系统生物学研究就是要将给定生物系统的基因 ,转录 ,蛋白质和代谢水平所发生的事件 ,相关性及其对所涉及生物过程的意义进行整体性认识，从而出现了许多的 “组 “和 “组学 “的新概念 .13江南大学现已提出的一百多个 “组 “和 “组学 “,可以大体归纳为 “基因组 “/“基因组学“,“转录组 “/“转录组学 “,“蛋白质组 “/“蛋白质组学 “和 “代谢组 “/“代谢组学 “四个方面 .显而易见 ,DNA,mRNA以及蛋白质的存在为生物过程的发生提供了物质基础 (但这个过程有可能不发生 !),而代谢物质所反映的是已经发生了的生物学事件 .因此代谢组学是对一个生物系统进行全面认识的不可缺少的一部分 ,是全局系统生物学 (global systems biology)的重要基础14江南大学第二章 微生物代谢组学的研究方法Challenges of MetabonomicsSample Complexity and Data HandlingEach sample has,a wide range of compound classesa wide variation in metabolite concentrationsa large number of potential componentsEach group of samples has,many sample analyses are required for statistical relevancea complex raw dataset that needs to be processeddifferences between sample groups which need to be highlighted15江南大学代谢组学 (metabonomics metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的 研究思想 ，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其 研究对象 大都是相对分子质量 1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的 基本方法 。 16江南大学代谢组学 利用 高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术， 动态跟踪 细胞、有机体分泌出来的体液中的代谢物的整体组成， 借助 多变量统计方法，来 辩识和解析 被研究对象的生理、病理状态及其与环境因子、基因组成等的关系。“ 代谢组学 ” 是一种整体性的 研究策略 ，其研究策略有点类似于通过分析发动机的尾气成分，来研究发动机的运行规律和故障诊断等的 “ 反向工程学 ” 的技术思路。由于代谢组学着眼于把研究对象作为一个整体来观察和分析，也被称为 “ 整体的系统生物学 ” 。 17江南大学研究方法和步骤1.样品制备：足量的代表性样品（ -80 保存）2.数据采集和标志物识别：常用色谱 -质谱联用 、 NMR3.数据分析： PCA、 PLS、 ANN4.代谢途径分析：代谢轮廓分析和代谢组学分析18江南大学The strategy for large scale metabonomics research19江南大学样品制备微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取。根据研究对象、目的和采用的分析技术不同 ,所需的样品提取和预处理方法各异，不存在一种普适性的标准化方法。微生物代谢组学研究要求微生物的生长条件是可以控制和重复的。在一个生物反应器中，需要严格控制温度、 pH、培养基组成、溶解氧和二氧化碳等以明确界定生长条件，建立标准的和可重复的参考培养条件。微生物的培养可以以分批、补料或者连续培养模式进行。由于连续培养的菌体生理稳定，易于控制且重现性较好，所以，大多数研究者倾向于应用生物反应器连续培养操作模式。 20江南大学在样品淬灭和代谢物的提取过程中，应遵循的原则是：（ 1）淬灭工艺最好可以立即冻结细胞代谢（ 2）在淬灭过程中要求细胞膜无明显损伤，以免胞内代谢物外泄。（ 3）提取过程中应该尽可能多的提取胞内代谢物。（ 4）代谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰。（ 5）得到的样品基质应与所选择的分析方法相容。冷甲醇、液氮和热乙醇是最常用的淬灭方法，而在提取方面由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法应该根据不同的化合物选择不同的提取方法，并对提取条件进行优化。 21江南大学 对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关键步骤，也是最困难和多变的步骤。与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同，代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大，要对它们进行无偏向的全面分析，单一的分离分析手段往往难以保证。色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研究。22江南大学23江南大学一般来说 ,选择代谢物组学分析方法时 ,其原则是要同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度 ,找到一种最适合目标化合物的方法。 化学分析技术中最常用的是 1H核磁共振 (1HNMR)以及色谱质谱联用 (X-MS)，如气相色谱耦联质谱 (GC/MS)、液相色谱耦联质谱 (LC/MS)和毛细管电泳耦联质谱联用技术 (CE/MS)来分析研究代谢物并为其绘制图谱。这些技术的耦联可以提高对样品的分辨率、敏感性及选择度,有利于对更多的生物体系内的代谢物绘制图谱。24江南大学GC/MS 、 LC/MS和 CE/MS 可以同时检测出数百种化合物，包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物 。GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济，但需要对样品进行衍生化预处理，这一步骤会耗费额外的时间，甚至引起样品的变化。受此限制， GC/MS 无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。近来，多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质谱（ GC-GC-TOF-MS），检测范围更广，但由于实际应用困难和花费较高等问题使其并未普遍使用。25江南大学HPLC 与 GC 原理相似，但在进样前不需进行衍生化处理，适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。 HPLC/MS 选择性和灵敏度都较好，但分析的时间相对较长，且需依赖纯的参照物。CE-MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多，仅需要极少的进液量 nL），而且其测试时间短，试剂成本低。 CE-MS在微生物代谢组领域发挥着越来越重要的作用。色谱质谱连用技术具有分离效率高、灵敏度好及经济实用等优点。但需要解决的主要问题是：大量色谱峰的识别问题以及方法的重现性问题。26江南大学NMR是当前代谢组学研究中的主要技术首先，不同于质谱具有离子化程度和基质干扰等问题，NMR 没有偏向性，对所有化合物的灵敏度是一样的；其次，NMR 无损伤性，不破坏样品的结构和性质，可在接近生理条件下进行实验，可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，可以进行实时和动态的检测；此外， NMR 氢谱的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的，所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰，图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量，更为直观 。因此， NMR 方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。与 GC/MS 和 LC/MS 相比， NMR 的缺点是灵敏度低，有可能形成信号重叠，且其对样品制备的要求很高。同时因为动态范围有限，很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。 27江南大学数据分析平台 在代谢组学研究中，大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两类 (如基因突变前后的响应 )或多类 (如不同表型间代谢产物 )的判别分类以及生物标记物的发现。由于生物样品的组成复杂，在得到分析对象的原始谱图后，首先需要对数据进行预处理 (归一化和滤噪 )，消除干扰因素，保留有用信息。数据的解析可分为如下 3个基本步骤：(1)提取出色谱分离后