分子生物学常用技术上

1、分子生物学常用技术,PCR产物,A-T克隆,测序,重组表达载体,重 组 蛋 白,制备抗体,转 染 细 胞,(1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16过夜/22 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 2030%甘油-LB，-20/-70 ,步骤：,(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原

2、位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化,(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。 (17)作用机制,实验 XXX 设备：加样器 耗材 试剂和配制方法：详细 步

3、骤：详细,1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学,内容,核酸的基本组成,Albrecht Kossel,1910年诺贝尔生理或医学奖,揭示核酸的化学成分,“其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献”,Lord (Alexander R.) Todd,核苷酸的基本结构,1957年诺贝尔化学奖

4、,“核苷和核苷辅酶”,1962年诺贝尔生理或医学奖,“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”,DNA分子的二级结构,数量庞大 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 3，5-磷酸二酯键(共价键) 直线形多聚体 方向: 5-3 ，5 CAG. 3,特点,DNA半保留复制,变性与复性,变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。,一、核酸的分离、纯化和鉴定 基因组DNA的分离、纯化： PCR、Southern- blot、构建基因组文库 实验材料：哺乳动物组织(50100mg) 哺乳动物细胞(5x105107) 六孔板/T25,

5、实验步骤：RT 匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37/55 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O,注意事项： (1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80100kb,2. 总RNA的分离纯化: 略,3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行 复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA

6、分子。,合格质粒的组成要素,复制起始位点：原核1个，真核多个 抗性基因 多克隆位点 启动子 增强子 终止信号 加polyA信号,第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr ：水解-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr ：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr： 使潮霉素失活。,如何阅读质粒？,第一步：质粒类型：Ori位置，原核/真核/穿梭质粒；,第三步：多克隆位点，内切酶位点,第四步：外源基因插入片段大小，10kb， 大选大小找小,第五步：表

7、达系统元件：启动子 - 核糖体结合位点 - 克隆位点 - 转录终止信号。 克隆载体/表达载体,碱裂解法,Omega：Plasmid Mini KitI D6943-01 ？,4、核酸纯度的鉴定,OD260和OD280应大于0.05,OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质,浓度：1OD260：50g/ml 双链 DNA 40g/ml 单链 DNA，总RNA 35g/ml 单链RNA 20g/ml 单链寡核苷酸,纯度: OD260 / OD280 ：蛋白质污染程度，DNA 1.8，RNA 1.72.1 OD260 / OD230 ：碳水化合物污染程度，2.0,二、基因的克隆与鉴定方法,

8、基因的化学合成 目的基因的克隆策略 (1) 根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 (2) 根据表型变异克隆基因 (3) 基于图谱的基因克隆方法 3. 文库的构建与目的基因的克隆 4. PCR反应与目的基因的克隆 5. 目的基因克隆的鉴别与分析,基因的化学合成 前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列 适用：分子量较小、价值极高的目的基因 历史：1979年， Khorana等首次合成E coli酪氨酸tRNA基因 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法 方式：固相合成法和自动合成法,2. 目的基因的克隆策略,(1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 a.一个基因的序列已知：PCR技术，目

9、的DNA片段,b.一个基因的一段碱基序列已知： 反向PCR/RACE，cDNA全长； 探针：筛选cDNA文库，cDNA全长,c.一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较， 保守序列，探针/引物，文库筛选/PCR，从新物种中 分离功能相似的基因,d.已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的 核苷酸序列，探针，筛选基因组/cDNA文库，基因序列,(2)根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆,转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物,a.提总RNA: 具有对比意义的两组，注意痕量DNA的污染 b.反转录：得到细胞内所有基因的cDNA库 下游引物：12组，T12MN(M:A、C、G;

10、N:A、C、G、T) c.PCR扩增：32P，35S 上游引物：2426组，10mer 下游引物：同反转录 共计288312种PCR反应,mRNA 差异显示： DD-PCR，1992，只能分离与某种 处理或特征有关的基因,步骤：,d.电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影 e.克隆：PCR差异带的回收、扩增和克隆 f.Northern blotting鉴定：排除假阳性 g. 序列分析：Blast，递交新序列 h.全长基因： RACE或筛选cDNA文库 i.基因功能研究：生物信息学,扩增条件： 前14个循环采用不严格扩增条件(降低退火温度， 增加引物与Mg2+浓度)，促使引物与模板的错配

11、； 后续PCR循环则采用严格的扩增条件。,基因片段的开放读框,氨基酸序列的功能结构域分析,注意： a.与常规PCR不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例; b.由于某一刺激因素常常影响数十、甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用; c. 电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。,优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始RNA量 少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。 缺点：大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段， 且都靠近3端,发展：EDD、ODD、GDD、LDD、FDD(增强、有序、基因组、长程、荧光),消减杂交：又称扣

12、除杂交，克隆差异表达的基因,(3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱， 可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。,方法：染色体跳查：速度快，200kb片段 染色体步查：40kb片段,举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)-囊性纤维化(常隐) 亨廷顿病基因(HD)-亨廷顿病(常显) 肌营养不良基因(MD)-肌营养不良症(X隐),3. 文库的构建与目的基因的克隆,分类：按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类 cDNA文库：重组DNA片段来源于细胞表达出的mRNA， 用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及 表达基因的功能鉴定的研究。 基因组文库：重组片段供体是某种特定

13、生物个体的基因组DNA， 主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、 基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和 组织形式分析等方面的研究。,基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体。,(1)cDNA文库,步骤：cDNA合成，连接到质粒/噬菌体载体上， 转化或感染大肠杆菌，产生cDNA文库。,cDNA = copy DNA,cDNA文库的筛选：,(2)基因组文库,概念：是由大量独立克隆形成的群体，指能够代表某种 有机体整个基因组的一套克隆。,步骤：DNA样品的制备用限制性内切酶酶切基因组DNA 电泳分离回收约20kb的大片段与限制性内切酶处理 的载体连接在体外包装成噬菌体颗粒

14、，侵染大肠杆 菌文库的扩增,4. PCR反应与目的基因的克隆,发展历史 基本原理 反应体系 常见类型 建立PCR实验室,Kary B. Mullis,Michael Smith,PCR和定点突变突变,1993年诺贝尔化学奖,“发明了聚合酶链反应(PCR)的方法”,“开创了基于寡聚核苷酸的定点突变 方法及其在蛋白质研究中的发展”,(1)PCR发展史,1. 1983年春，Mullis提出PCR的概念； 2. 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个PCR实验，只一个循环； 3. 1983年12月，同位素标记的10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 4. 1985年12月

15、20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 5. 1985年10月25日申请PCR专利，1987年7月28日批准(专利号 4,683,202），这次Mullis是第一发明人。 6. 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习PCR方法； 7. 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是1985年春天Mullis建议做的； 8. 1988年，第一台PCR仪问世； 9. 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元代价从Ce

16、tus公司获得全权开发权。 10.1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,PCR仪的变迁,1. 三个水浴锅， 用手移动（Mullis等人当时用的） 2. 电加热块 自来水冷却 （PE，1988） 3. 电加热块 内置循环液冷却（PE，1989） 4. 三个加热块 机械手（Stratagene，1994） 5. 半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 6. 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 7. 风加热 8. Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1.1991

17、年出现三个水浴锅+机械手原始PCR仪(华美，复日等)； 2.现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）。,PCR相关的术语和产品,T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR,TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR

18、 green,(2)原理: 模板变性、引物退火、DNA 聚合酶进行DNA链延伸,PCR产物呈指数方式增加 ，2530个循环，理论109 分子，实际105107,PCR产物生成曲线,logDNA,Cycles,PCR,3 - 4 小时,特点：特异性、有效性、忠实性,1.操作简便省时； 2.灵敏度高； 3.特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性； 4.对原始材料的质量要求较低； 5.有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚合酶缺乏35核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。,a.模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合 DNA的蛋白质

19、污染。,b.引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。 0.10.5 mol/L,c.Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。,d.dNTP：50200mol/L，四种dNTP浓度相同。,e.Taq 酶：Klenow / Taq酶 / 高保真Taq酶, 2.5U/100l 。,f.参数：94 5min - 30(94 30sec - 55 30sec - 721 min) - 72 7min,(3)组成,10Taq Buffer 2.5l 引物(10mol/L) 21l H2O：管内总nmol数/10(ml) dNTP(2.5mmol/L ) 2.0l H

20、2O 16.2l Taq酶(0.5U/l ) 1.3l 4 模板 1l,25l PCR体系,PCR mix:：存于- 20 ,2.5mM dNTP 80l 10Taq buffer 100l H2O 648l,25l体系：20l反应 15l体系：12l反应,温度高，特异性高,2XMaster Mix = dNTP+ Taq酶+ Taq buffer+loading buffer,H2O 7l 引物(10mol/L) 21l Master Mix 10ul 模板 1l,Kit: 天根生化， 2XPfu Master Mix，加A尾？,影响因素,模板：ng级的质粒DNA，g级基因组DNA。 引物：

21、引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。特异性 Mg2+浓度：特异性及产量 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为2530个循环,DNA聚合酶催化DNA链的延伸,DNA聚合酶的活性,大肠杆菌的 DNA聚合酶,聚合酶：修复合成，不参与DNA复制,真核细胞的 DNA聚合酶：DNA聚合酶、mt,应用：双链DNA的3末端标记,Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 (Pyrococcus furiosus，Stratage

22、ne) Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs) Tfl DNA聚合酶 (Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme) FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilu

23、s？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, ,耐高温DNA聚合酶种类,1) 长度一般为18-25个碱基； 2) 尽可能择碱基随机分布的序列； 3) 两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为4555%； 4) 避免引物内部形成二级结构； 5) 两引物之间不应发生互补，特别是在3端; 6) 引物3末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好选T、G 或C，而非A； 7) 引物5端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。,引物设计,原则,软件/网站：？,第一步：查找目的基因序列：mRNA序列(NCBI, GenBank),第二步：核酸内切酶位点分析,此处粘贴序列,第三步：选择载体,原核表达载

24、体：His: pET, pRSET GST: pGEX 真核表达载体：pcDNA3, pcDNA3.1 myc: pCMV-myc, pcDNAmyc/His, pSecTag2 HA: pcMV-HA Flag GFP: pEGGFP-N, pEGFP-C, pIRES2-EGFP RFP 病毒表达载体：pAdEasy 。,His-tag,GGA GA A,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15 46 ccc ttc tgc cct

25、cct ttg ctg gcg aca gcc tct caa atg cag atg 90 16 P F C P P L L A T A S Q M Q M 30 541 gac gta gaa gca gct ctg acc aaa gcc ctt ggg gaa gtg gac att 585 181 D V E A A L T K A L G E V D I 195 586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L *,。,5 保护碱基+ 酶切位点+ 起始密码 +目的基因5

26、末端序列 3,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15,上游引物,上游有标签 读框,586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L *,下游引物: 反向互补,5 保护碱基+ 酶切位点+ 终止密码 +目的基因3末端反向互补序列 3,下游有标签 读框,1) T=2(A+T)+4(G+C)-35 2) T=22+1.46 ln35

27、 ln=2(G or C)+(A or T) 2035nt 3) T=81.5+16.6lgJ+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%) J+=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 1470nt,温度高，特异性高,退火温度,图PCR产物电泳结果(1.5% Agarose) 1.DNA相对分子质量DL2000; 2. PCR产物; 3. PCR空白对照。,a.样品准备区：提取核酸,在没有DNA的干净环境中进行,PCR实验室,b.前PCR区：加样区，配制所用的试剂。,c.后PCR区：反应后处理样品 这一区域

28、的所有试剂和仪器不能用于任何前PCR活动,a. 阴性(无模板)、阳性对照(阳性模板) b. 配制PCR混合物：PCR buffer + dNTP + H2O c. 控制污染: 靶序列污染，气溶胶,注意事项,实验室分区； 紫外线(距离1m，400W/cm2)照射； 更换试剂； 换仪器； 换实验室； 用另一套引物； 用化学法修饰DNA； 停试验。,限制性核酸内切酶：,识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类核酸内切酶。,+,Bam H,命名原则,EcoR I,“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用”,1978年诺贝尔生理或医学奖,Werner Arber Danie

29、l Nathans Hamilton O Smith,按组织特点分类：,GGCA,酶活性单位,一个活性单位：在适当的反应条件，1小时， 完全酶解1g DNA底物，限制性内切酶的量。,标准的酶解反应：50l反应体系，1U内切酶， 最适反应条件， 1小时，1g DNA完全降解。,单酶切/双酶切反应：30 l,37 24h,1.质粒 2,5.质粒2种内切酶 3.DNA/Hind 4. DL2000,迁移率：同样大小分子 超螺旋 线性分子 缺口或松弛 环状 线性/缺口,影响因素,DNA：纯度、甲基化程度、分子结构 缓冲液：pH值 溶液：离子种类及浓度 消化反应的温度 反应体系中甘油浓度,星号活力：St

30、ar活力， 改变酶反应条件，识别特异性降低，共性，(*),甘油含量高：酶量不超过反应体积的10%； 1/30 内切酶用量过大：100U/gDNA； 210U/g DNA 离子强度低：25mmol/L； 推荐Buffer pH值高：pH7.58.5, EcoRI出现*；pH7.0 含有机溶剂：DMSO，乙酸等; DNA纯度 二价阳离子：Mn+, Co+, Zn+等； Mg+,诱发因素：,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam

31、 H,Bg l,+,+,T4DNA连接酶 16 12h 4 12h 室温 15min,连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶,同一限制酶切位点连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,不同限制酶切位点的连接,平端连接,Eco R,人工接头,互补现象,pUC系列质粒 (lac操纵子),-半乳糖苷酶氨基端,细菌 (-半乳糖苷酶氨基端缺陷型),蓝色菌落,外源DNA插入,白色菌落,-半乳糖苷酶,缺陷型,蓝白筛选,a. 大量扩增目的核酸片段 b. 检测基因的整合、表达情况 c. 在核酸中引入突变 d. 核酸测序 e. 克隆新基因 f. 生物多态性的

32、研究,应用,医学领域,a. 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 b. 致病病原体的检测 c. 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 d. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 e. 其他：动、植物检疫（转基因动植物检测）,长片段PCR,Taq酶：LA Taq酶( 5U/ 50l反应) dNTP: 2.5mM 8 l 延伸：5min 循环：25,-Hind,第一轮PCR,巢式PCR: 模板数低，增加特异性扩增，提高扩增效率。 需要两到三对引物,反转录PCR：RE-PCR，略,b. 当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下方法。,研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要工具

33、。,定点突变：,a. 突变位点位于基因两侧，在引物中加突变碱基；,方法一,方法二,定量PCR,普通PCR：对终产物进行定性和半定量分析； PCR 产物的长度从100bp数kb。 定量PCR：实时检测每个循环扩增产物量的变化； 通过Ct值和标准曲线对起始模板定量分析； PCR产物长度一般在 60150 bps。,logDNA,不同样品有不同的生成曲线,非特异性：SYBR Green：与DNA双链的小沟结合，双链时 有荧光，单链时无荧光。 特异性：Taq man：水解型杂交探针，5端有报告基团R，3端 有荧光淬灭基团Q，R和Q分开时有荧光。 Molecular Beacon：分子信标，一端有荧光素

34、，另一 端有淬灭剂的发夹探针，环与目标序列互 补，颈由互补配对序列组成。,荧光标记试剂,SYBR green,SYBR green,优点：对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA； 使用方便，不必设计复杂探针； 非常便宜， $1 / PCR 反应 缺点：容易与非特异性双链结合，产生假阳性，需要努力 优化反应条件； 对引物特异性要求较高。,应用范围：起始模板测定；基因型分析；溶解曲线分析。,Taq Man,ABI 公司 1995年11月申请专利。,应用范围：起始模板定量，基因型分析，目的基因定量， 产物鉴定，SNP分析。,优点：对目标序列的特异性高，阴性结果确定； 设计相对简单，与目标序列某一区域互补； 重复性比较好。 缺点：只适合一个特定的目标； 委托公司标记，价格较高； 不易找到本底低的探针。,Taq Man,Molecular Beacon,Molecular Beacon,应用范围：起始模板定量，基因型分析，产物鉴定，SNP分析。,优点：高特异性，是对目标序列检测SN