第二章蛋白质的制备(2).ppt

1、第四节 层析技术,引言,层析法的基本原理,层析法的分类, 吸附层析技术, 分配层析技术, 凝胶过滤层析技术, 离子交换层析法, 亲和层析法, 高效液相层析（HPLC）,引言,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett(茨维特)发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1944年出现纸层析。 以后

2、层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,层析法的基本原理,层析法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、色谱法。 利用了混合物中各组分物理化学性质的差异:如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等。,层析的基本概念,固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）

3、，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,层析法的分类,按两相所处的状态分类： 流动相有两种状态：液体、气体 固定相的两种状态：固体、液体 按两相所处的状态分为： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析,按层析过程的机理分类：,按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附

4、剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等通常都采用柱层析形式。, 吸附层析技术(Absorption Chromatography),一、基本原理 吸附层析法（液-固层析法，LSC） 原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。 吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，常用的有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等 特点：适合分离不同种

5、类的化合物。,吸附剂吸附能力的强弱与被吸附物质的化学结构、溶剂的本质和吸附剂的本质有关。 当改变吸附剂周围溶剂成分时，吸附剂对被吸附物质的亲和力便发生变化，使被吸附物质从吸附剂上解脱下来，这一解脱过程称为“洗脱”或“展层”。,吸附层析是把吸附剂装入玻璃柱内（吸附柱层析法）或铺在玻璃板上（薄层层析法）. 由于吸附剂的吸附能力可受溶剂影响而发生改变，样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力，使之解吸，随洗脱液向前移动。 反复的吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，物质即可沿着洗脱液的前进方向移动。 其移动速度取决于吸附剂对该物质的吸附能力。,活性炭对芳香族化合物的吸附力大于

6、脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。 分离水溶性芳香族物质与脂肪族物质，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽。,活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。, 分配层析技术（Partition Chromatography）,分配层析法（液-液层析法，LLC） 原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。,分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。 K=c1(流动相) /c2 (固定相) 分配系数小的溶质在固

7、定相中的分配的数量多，移动慢；分配系数大的溶质在流动相分配的数量多，移动快。因此可彼此分开。,特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体,在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。,层析柱分离物质的示意图：,固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在

8、固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配。, 凝胶过滤层析技术 (Gel Filtration),一、基本原理 概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,二、凝胶的种类 1.交联葡聚糖凝胶（Sepha

9、dex) 1) Sephadex G G 后的数字为每克干胶吸水量（mL）的10倍.。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2） Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。 2.琼脂糖凝胶（Sepharose ;pharmacia;Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 3.聚丙烯酰胺凝胶 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶-P（Bio-Gel P)。 4.聚苯乙烯凝胶（Styrogel) 大网

10、孔结构。,三、 凝胶过滤在试验室中的应用,1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关， LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。,原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。 将离子交换树脂装入层析柱。 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有

11、碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。, 离子交换层析法（Ion-exchange Chromatography）,离子交换层析的基本原理,+,+,+,+,+,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,洗脱待分离物质时常用的两种方法 制作电解质浓度梯度，即离子强度梯度。通过不断增加离子强度，吸附到交换剂上的物质根据其静电引力的大小而不断竞争性的解脱下来。

12、 制作pH梯度，影响样品电离能力，也使交换剂与样品离子亲和力下降，当pH梯度接近各样品离子的等电点时，该离子就被解脱下来。,交联葡聚糖离子交换剂,平衡离子,高分子聚合物基质,电荷基团,原理：利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱即可除去杂质。被结合的物质可用改变流动组成分或用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。, 亲和层析法(Affinity Chromatography),+,C,C,配基,1.配基固相化,2.亲和

13、吸附,3.解吸附,C,Affinity chromatography, 高效液相层析(HPLC) (High-performance liquid chromatography),特点： 使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而分辨率很高。 溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。,高压泵 高效分离柱 高灵敏度检测器,第五节 电 泳 技 术,引言, 电泳的基本原理, 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 毛细管电泳,一、概述,二、聚丙烯酰胺凝胶的制备,三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳, SD

14、S-PAGE, 免疫电泳 免疫印迹法,引言,电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1809年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。 但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后. 近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,1.电泳的概念,按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是

15、指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,引言,2.电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一

16、板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,3.电泳形式的演进,引言, 电泳的基本原理,电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。,.,在一定pH条件下，每一种分子

17、都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,+,-,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=EQ （1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV 当F引=F阻时 EQ= 6rV V= 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 ()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状也有关。

18、,EQ,6r,（2）,（3）,（4）,由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。,EQ,6r,（4）,V=,由于蛋白质、氨基酸等的电离度随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率m和当时条件下电离度的乘积。 U = m （6） 将（6）式代入（5）式得： U = （7）,.,Q,.,

19、6r,由（7）式可以看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度的因素如pH的改变，都会对有效迁移率产生影响。,在电场中液体相对于固体的移动称为电渗。 在琼脂凝胶电泳中，由于琼脂是带负电荷的极性基团(如SO42-、COO-)，使琼脂成为负电的固相，静电感应作用使琼脂网格附近的水带正电，因此，液体向负极流动，形成电渗力。 带电质点泳动时受电泳力和电渗力的共同作用。如电泳力低于电渗力，则向负极移动。 如抗体，在碱性环境带负电，应向正极移动，但由于其等电点较高，电荷少，抵不过电渗力而泳向负极。,一,+,+,-,电泳时通常应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液

20、。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢,此时需要低电压，避免过多产热，但又延长电泳时间；反之离子强度过低，则溶液的缓冲能力差,不易维持所需要的pH,影响带电颗粒带电荷状态而影响电泳. 一般最合适的离子强度在0.05-0.10 mol/L 之间。 总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。, 聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropho- resis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方

21、 法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质 稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2,丙烯

22、酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,二、聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成氧自由基，这些自由基的产生可引发丙烯酰胺单体形成自由基，从而可与甲叉双丙烯酰胺发生聚合、交联反应，形成有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。,., 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻

23、止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。或在胶液表面，往往覆盖一层水，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。,2.光聚合,胶体的聚合反应：,Ammonium persulfate (free radical initiator),Acrylamide (monomer),Bis(acrylamide) (bridge),TEMED (catalyst),自由基的生成者,成胶的基本单位,架桥使聚合产生分枝,帮助传递自由基的催化剂,Acrylamide 有毒性！,CH

24、2=CH-CO-NH2,1,2,架桥物造成分枝,端点自由基可在延续,free radical,Bis,Bis,聚合反应,交错连接, 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为： T= C= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔 径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度过小，凝胶稀 软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时， 凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。,三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）

25、,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%, 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20%蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。,四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶

26、。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应，分子筛效应和浓缩效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。,8.3,8.3,8.9,6.7,-,+, 电泳胶体系统的组成：,1,电泳系统,pH,胶体浓度,缓冲液,上层(负极)缓冲液,2,样本溶液,3,浓缩胶体,6.7,4,分离胶体,胶 体,5,下层(正极)缓冲液, 胶体的不连续性有浓缩样本的作用,图4 电泳过程

27、示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,电泳条带, SDS-PAGE,凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。 一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

28、含去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸35分钟）。 通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。,经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。 SDS是带有负电荷的分子，它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。 所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近

29、似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。 SDS-PAGE中，去污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的蛋白质样品的变性状态。, SDS 在蛋白质表面 均勻敷上 一层负电：,SDS,变性蛋白质成一线状分子,原态蛋白质,并且均勻带上一层负电荷,非极性尾部,极性头部,SDS-PAGE基本上是一种分析工具，但有时也可用于纯化蛋白质。 变性的蛋白质可以通过切下凝胶上蛋白带的方法从凝胶中回收，然后再通过电洗脱仪将凝胶中的蛋白洗脱到缓冲液中，再经过浓缩和除盐

30、，这样制备的蛋白样品可以用于蛋白质的结构分析或抗体的制备。 在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移。它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比。,凝胶通过染色出现不同的蛋白带。未知蛋白质的分子量（严格讲应是多肽链的分子量）可以通过与同一块凝胶上参考蛋白的迁移率相比较计算出来。 在SDS-PAGE中，在一定的凝胶浓度下，蛋白质的分子量对数与多肽链的迁移率成线性关系。 依据标准蛋白迁移率画出的标准蛋白分子量对数对它们迁移率的标准曲线，根据未知蛋白迁移率就可从标准曲线上求出未知蛋白的分子量。,SDS-PAGE separates proteins by MW,19

31、68年，Margolis 和 Slater等以聚丙烯酰胺为支持物制备成孔径梯度(pore gradient)或称为梯度凝胶,进行PG-PAGE分离鉴定,并首次用来测定蛋白质的分子量。,2%或4%,16%或30%,蠕动泵,浓,稀,50,000-2,000,000 4-30% 100,000-5,000,000 2-16%,可以使样品各组分充分浓缩 提供更清晰的蛋白质区带,用于纯度鉴定 可在一个凝胶上，同时测定几个M相差很大的蛋白 可直接测定天然状态的蛋白质M,可作为SDS-PAGE的补充,适合于测定球状蛋白 电泳需要足够高的电压,优缺点, 三种不同性质蛋白质的电泳比较：,X,Y,Z,-,-,+,

32、X,Y,Z,+ SDS,Native-PAGE,SDS-PAGE,分子量 及 净电荷密度 均影响泳动速率,只有 分子量 影响泳动速率,-,+,-,毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）,是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，它迅速发展于80年代后期。 毛细管电泳技术实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平。 毛细管电泳技术的基本原理是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力

33、，依据样品中各组分之间带电性和分配行为上的差异而实现的电泳分离分析方法。,毛细管电泳 (capillary electrophoresis),电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow,当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。,HPCE中的电渗现象与电渗流

34、,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向阴极移动，速度电渗流。,HPCE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性 表面键合阳离子基团。 （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反

35、电荷的电极移动。正、负样品及不带电的中性分子以不同的速度移动。 由于电渗作用，其电渗速度一般比样品的电泳速度大，使它们都向负极移动。 对荷正电的分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，因而移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。,典型毛细管电泳实验的步骤：,将运行缓冲液充满毛细管柱； 移去进样端缓冲液池，用样品代替； 用电动或压力进样方式进样； 将进样端缓冲液放回； 毛细管两端加操作电压进行电泳分离； 分离样品迁移至检测窗口检测，数据记录和处理。,毛细管电泳技术发展迅速，是色谱最活跃的领域之一。毛

36、细管电泳技术分离模式主要有以下几种。 （1）毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis, CZE） （2）胶束电动毛细管色谱（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC）（3）毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE） （4）亲和毛细管电泳 （5）毛细管电色谱（Capillary Electrochromatography, CEC） （6）毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF） （7）毛细管等速

37、电泳，（Capillary isotachophoresis, CITP）（8）CE/MS联用,毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是（三高两少）： （1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。（2）分析速度快（通常不超过30分钟），分离效率高，分辨率高，灵敏度高。（3）操作模式多，开发分析方法容易。（4）实验成本低，消耗少。（5）应用范围极广。 但仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备。,免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP) 是将区带电泳分离和专一性免疫沉淀反应相结合的免疫化学方法称为凝胶免疫电泳。,先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗

38、原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。 然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。 分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。 根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。常用于在复杂混合物中检测一种或几种抗原。,普通免疫电泳原理（Grabar-Williams),火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis，RIEP) 是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。可用于快速检测单个抗原的浓度。,把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其 沉淀形似火箭，故称为火箭电泳。也有人称其 为电免疫扩散(electro-immunodiffusion, EID)。,火箭电泳图 为标本；为标准抗原,原理 电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。 将待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比