核酸分子杂交技术.ppt

1、核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。,核酸杂交,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。,（二）复性 定义：变性的单链核酸分子

2、在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,二、影响杂交的因素,1. 核酸分子的浓度和长度,2. 温度：比Tm低2530较适宜,3. 离子强度：离子强度杂交反应率,4. 杂交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到3042。 使用甲酰胺的优点：,低温下探针更稳定； 能更好地保留非共价结合的核酸。,5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度 （2）Cot与反应体

3、系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,第二节 探针,一、探针的种类,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,基因组DNA探针,从基因组DNA文库中选取某一基因片段, 与载体连接（质粒、噬菌体）, 克隆(PCR扩增), 酶切,优点：无性繁殖、制备方法简单；不易降解（与RNA比较）；标记方法成熟。,cDNA探针（c

4、omplementary DNA）,S1核酸酶切平两端,优点： 不含内含子及高度 重复序列,但不易获得, 克隆,通过逆转录,加接头 限制酶 粘性末端, 双链cDNA, 载体连接,优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。,缺点：易降解，标记方法复杂,RNA探针：检测DNA和mRNA,寡核苷酸探针,优点：可根据需要合成相应序列； 探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短; 长 度只有1050bp，该识别序列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。 可大量合成，价格低，能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。,二、标记物 （一）理想标记物应具

5、备的特性：,高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,(二) 标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光,三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中,体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的

6、活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上,四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,第三节 核酸分子杂交的方法,按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固相杂交 sout

7、hern印迹杂交 northern印迹杂交 斑点杂交 原位杂交 液相杂交,一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记,（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液

8、中和凝胶中的缓冲液,（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程,1、固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少,常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低,2.Southern印迹的常用方法 毛细管虹

9、吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,（五）Southe

10、rn杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA,（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA,三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA

11、 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定,2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间