微生物学实验讲义

1、目 录实验一 微生物制片及形态观察1一、显微镜油镜的使用1二、细菌简单染色法及形态观察3三、革兰氏染色法6四、细菌的芽孢染色8五、放线菌的形态结构观察10六、霉菌的形态结构观察11七、酵母菌的形态结构观察12实验二 微生物显微计数及活菌观察13一、血球计数板的使用及酵母菌的显薇计数（暗视野）13二、大肠杆菌活菌的运动观察15三、放线菌及霉菌的水悬液观察17实验三 培养基的配制及灭菌18一、培养基的常规配制程序19二、细菌、放线菌常用培养基的配制24三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制26四、高压蒸汽灭菌28实验四 微生物的分离与纯化31一、微生物的接种技术32二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的

2、分离与纯化37实验五 环境因素对微生物生长的影响45实验六 微生物深层培养生产-淀粉酶及其酶活测定47实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵50实验八 硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生-淀粉酶的诱变效应55附 15升发酵罐操作示范58实验一 微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图11

3、）。图11 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光

4、源。2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物

5、镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈（即可变光栏）应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。2）高倍镜观察显微镜的设计一般是共焦点的，低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。转换物镜后，要同时调节虹彩光圈的大小，使之与所使用物镜放大倍数相同的刻度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。3）油浸镜观察油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。

6、使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。4. 注意事项显微镜是精密贵重的仪器，必须很好

7、地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：1）观察完后，移去观察的载玻片标本。2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脱

8、脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的透镜。如果还不能除去，再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。二、细菌简单染色法及形态观察运用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察是实验室常用方法，然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察细菌时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难

9、以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于着色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构，因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够形成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料

10、和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、蕃红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。（一）目的要求学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。初步认识细菌的形态特征。巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。（二）基本原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察

11、。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。石碳酸复红染色液着色快，时间短，菌体呈红色；美蓝染色液着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色；草酸铵结晶紫染色液染色迅速，着色深，菌体呈紫色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。（三）实验材料1

12、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。2染色剂：吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。3仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。（四）实验步骤1 涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取12环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，分别从以上菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取23环直接涂于载玻片上（图12）。载玻片要洁净无迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2 干燥室温自然干燥或烘干。3 固定涂面朝上，通过火

13、焰23次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4 染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。草酸铵结晶紫染色约1 min，或吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色12 min。5 水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。6 干燥自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。7 镜检涂片干后镜检。涂片

14、必须完全干燥后才能用油镜观察。图12 简单染色无菌操作及涂片、干燥和热固定过程图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干（五）实验报告内容根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。（六）思考题1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？3. 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又

15、会怎样呢？三、革兰氏染色法（一）目的要求学习并初步掌握革兰氏染色法。了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。（二）基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁

16、的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。现在一般认为革兰氏阳性菌体内

17、含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。（三）实验材料1菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。2染色剂：革兰氏染色液。3仪

18、器或其他用具同实验一。（四）实验步骤1制片取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色12 min,水洗。 3媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4脱色用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030s。 5复

19、染用蕃红液复染约2 min，水洗。 6镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。 7混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。（五）实验报告内容列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。（六）思考题 1你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 3你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。

20、4进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？ 5革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ 6你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？图13 革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌染色效果四、细菌的芽孢染色（一）目的要求学习并掌握芽孢染色法。初步了解芽孢杆菌的形态特征。（二）基本原理芽孢又叫内生孢子（endospore）是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之

21、一。由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱， 当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。（三）实验材料1菌种枯草芽孢杆菌的斜面培养物。2染色剂5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。3仪器或其

22、它用具小试管，滴管，烧杯试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。（四）实验步骤1）制片：按常规涂片、干燥、固定。2）染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5min。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。3）水洗：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。4）复染：用番红染液复染2 min 。5）水洗：用缓流水洗后，吸干。6）镜检：干后油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。（五）实验报告内容绘图表示枯草芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征。）（六）思考题1.

23、说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？2. 用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？3. 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？五、放线菌的形态结构观察（一）目的要求学习并掌握放线菌形态结构的观察方法。观察放线菌的菌落特征、个体形态及其繁殖方式。（二）基本原理放线菌的菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝体分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪

24、状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。图14 放线菌菌丝形态（三）实验材料1菌种灰色链霉菌（培养好的菌落平板及菌苔斜面）。2其它物品载玻片及盖玻片、0.1美蓝染液。（四）实验步骤1个体形态特征的观察用接种铲取下一小菌苔的一薄层培养基，平置于载玻片上，然后分别在低倍镜和高倍镜下观察。注意放线菌菌丝直径的大小，孢子丝的形状。哪种菌的孢子丝呈螺旋状？2.

25、孢子形状的观察 以无菌操作用接种环分别取少许灰色链霉菌涂布于载玻片上。在载玻片上加一小滴0.1%美蓝染液，将盖玻片轻轻盖在染液上，注意不要有气泡，吸水纸吸去多余的染液，在高倍镜下观察孢子丝及孢子的形态，有些制片也能观察到无隔的气生菌丝。（五）实验报告内容1. 描述你所观察到的放线菌菌落特征。2. 绘图：灰色链霉菌和淡紫灰链霉菌的气生菌丝、孢子丝及孢子的形态。（六）思考题1. 放线菌为何属于原核微生物？2. 放线菌与细菌菌落最显著的差异是什么？ 六、霉菌的形态结构观察（一）目的要求观察霉菌菌落特征。学习并掌握霉菌的制片方法。观察霉菌的个体形态。（二）基本原理霉菌是由许多交织在一起的菌丝体构成。在

26、潮湿条件下，生长繁殖长出丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体，并在形态及功能上分化成多种特化结构。菌丝在显微镜下观察呈管状，有的有横隔，将菌丝分割为多细胞（如青霉、曲霉），有的菌丝没有横隔（如毛霉、根霉）。菌丝的直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到十几倍。菌落形态较大，质地较疏松，颜色各异。菌丝体经制片后可用低倍或高倍镜观察。在观察时要注意菌丝直径的大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子种类及着生方式。图15 霉菌菌丝形态结构（隔膜）（三）实验材料1菌种黑曲霉、毛霉的斜面培养物。2其它物品蒸馏水、载玻片、盖玻片等。（四）实验步骤 个体形态特征的观察：于洁净的载玻片中央，

27、滴加一小滴蒸馏水，然后用接种针从菌苔边缘挑取少许菌丝体置于其中，使其摊开，轻轻盖上盖玻片（注意勿出现气泡），置于低倍镜、高倍镜下观察。1）观察黑曲霉菌丝体有无横隔、足细胞，注意分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子着生状况及形状。2）观察毛霉的无横隔菌丝（注意菌丝内常有气泡，不是横隔）、孢子囊柄、孢子囊及孢囊孢子。孢囊破裂后能观察到囊托及囊轴。（五）实验报告内容绘制黑曲霉、毛霉的个体形态图。（六）思考题 总结在显微镜下看到的黑曲霉、毛霉个体形态上的异同。 七、酵母菌的形态结构观察（一）目的要求观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。（二）基本原理酵母菌细胞的个体形态、繁殖方式及菌落特征

28、。在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为15530m、，最大可达100m。各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。大多数酵母在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶见黑色）。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。观察酵母菌个体形态时，应注意其细胞形状；无性繁殖是芽

29、殖或裂殖，芽体在母体细胞上的位置，有无假菌丝等特征；有性繁殖形成的子囊和子囊孢子的形状及数目。图15 酵母菌形态结构（箭头示出芽细胞）（三）实验材料1菌种酿酒酵母。2染液及溶液7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液。3其它物品载玻片及盖玻片等。（四）实验内容个体形态特征与出芽繁殖的观察：酵母细胞较大，用水浸片法观察，即在载玻片中央滴加一小滴无菌水或滴加0.1%美蓝液一小滴，无菌操作用接种环取酿酒酵母少许（并注意酵母菌与培养基结合是否紧密），置于无菌水或美蓝液中，使菌体与其混合均匀。将盖玻片斜置轻轻盖在液滴上。制片先用低倍镜，再换高倍镜观察酵母细胞的形状及出芽方式。（五）实验报告内容绘图：酿酒酵母

30、的菌体、出芽方式。 （六）思考题1. 酵母菌和细菌细胞在形态、结构上有何区别？2. 在同一平板培养基上若同时有细菌及酵母菌两种菌落，如何识别。3. 细菌、放线菌、霉菌及酵母菌菌落特征如何识别？个体形态有何差别？实验二 微生物显微计数及活菌观察一、血球计数板的使用及酵母菌的显微计数（暗视野）（一） 实验目的学习血球计数板的使用。直接计数法测定样品中酵母细胞数。（二）实验原理利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。图21 两种血球计数板血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个

31、方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但是不论哪一种，一个大方格，都等分成（2516或1625）400个小方格。（图21）因为每个大方格边长为1毫米，载片与盖片间距离为0.1毫米，所以每个计数室（1个大方格）体积为0.1立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1毫升菌液内所含的菌数。（三）实验材料1. 器材血球计数板、计数器、显微

32、镜。2. 菌种酿酒酵母菌液。（四）操作步骤1. 血球计数板的操作1） 取一个清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片放置在计数室上；2） 把在液体培养基上室温培养了2448h的酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有35个酵母菌为宜；3） 摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜太多），使菌液自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；注意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5 min；4） 将计数板放置在显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下进行观察和计数。2. 计数方法1） 不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（1625），应当

33、数4角4个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方格的（2516），除取4角4个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。注意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数；位于两个中方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上不数下，数左不数右；2） 每个样品重复计数23次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平均值；3） 按下列公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数；1625计数板：每个小方格内菌数4106稀释倍数2516计数板：每小方格内菌数4106稀释倍数（五）实验报告内容记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细

34、胞数。（六）思考题1. 在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌液？能否先滴加菌液再盖盖玻片？2. 用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？3. 计数细菌数目时此法是否适用？二、大肠杆菌活菌的运动观察（一）实验目的学习了解在暗视野中观察细菌的运动。（二）实验原理鞭毛（flagellum，复flagella）是生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，其数目为至数十条，具有运动功能。鞭毛的长度一般为1520m，直径为0.01l0.02m。观察鞭毛最直接的方法是用电子显微镜，用特殊的鞭毛染色法使染料沉积在鞭毛上，加粗后的鞭毛也可用光学显微镜观察。在暗视野中，对水浸片或

35、悬滴标本中运动着的细菌，也可根据其运动方式判断它们是否具有鞭毛。在下述两种情况下，单凭肉眼观察也可初步推断某细菌是否存在着鞭毛：在半固体(含0.30.4琼脂)直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若在穿刺线周围有呈混蚀的扩散区，说明该菌具有运动能力，并可推测其长有鞭毛，反之，则无鞭毛；根据某菌在平板培养基上的菌落外形也可推断它有无鞭毛，一般地说，如果该菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该菌运动能力很强，反之，若菌落外形圆整、边缘光滑、厚度较大，则说明它是无鞭毛的细菌。原核微生物(包括古生菌)鞭毛的构造由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌和阴性细菌在基体的构造上稍有

36、区别。革兰氏阴性细菌的鞭毛最为典型，现以大肠杆菌的鞭毛为例。它的基体(basal body)由四个盘状物即环(ring)组成，最外层的L环连在细胞壁最外层的外膜上，接着是连在肽聚糖内壁层的P环，第三个是靠近周质空间的S环，它与第四个环即M环连在一起称SM环或内环，共同嵌埋在细胞质膜上。SM环被一对Mot蛋白包围，由它驱动SM环快速旋转。在SM环的基部还存在一个Fli蛋白，起着键钮的作用，它可根据细胞提供的信号令鞭毛进行正转或逆转。目前已清楚地知道，鞭毛基体实为精致、超微型的马达，其能量来自细胞膜上的质子动势(proton motive potential)。据计算，鞭毛旋转一周约消耗1000个

37、质子。把鞭毛基体与鞭毛丝连在一起的构造称钩形鞘或鞭毛钩(hook)，直径约17 nm，其上着生条长约1520m的鞭毛丝(filament)。鞭毛丝是由许多直径为4.5 nm的鞭毛蛋白(flagellin)亚基沿着中央孔道(直径为2 nm)螺旋状缠绕而成，每周为810个亚基，鞭毛蛋白是一种呈球状或卵圆状蛋白，相对分子质量为3万6万，它在细胞质内合成，由鞭毛基部通过中央孔道输送到鞭毛游离的顶部进行自装配。因此，鞭毛的生长方式是在其顶部延伸而非基部延伸。图22即为革兰氏阴性细菌鞭毛的构造模式图。革兰氏阳性细菌的鞭毛结构较为简单。枯草芽抱杆菌鞭毛的基体仅有S和M两个环，而鞭毛丝和钩形鞘则与革兰氏阴性菌

38、相同。图22 革兰氏阴性细菌鞭毛的构造鞭毛的功能是运动，这是原核生物实现其趋性(taxis)即趋向性的最有效方式，其运动方式主要是作旋转运动。鞭毛的着生方式有，端生、周生和侧生等三种类型。（三）实验材料1. 菌种大肠杆菌。2.实验器材显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种针。（四）实验步骤1. 取一洁净的血球计数板或载玻片；2. 在载玻片上滴23滴无菌水；3. 取接种环，灼烧，在试管斜面上取一环大肠杆菌，在滴有无菌水的载玻片上制成菌悬液；4. 用滴管取一小滴滴在盖玻片上，并将盖玻片扣在血球计数板的凹槽上，或直接将盖玻片盖在菌悬液上，放在显微镜下进行观察。（五）实验报告内容描述大肠杆菌的运动方

39、式。（六）思考题为什么在显微镜下观察细菌运动要将可变光栏调到最小（暗视野）？三、放线菌及霉菌的水悬液观察（一）实验目的观察了解不同菌丝的形态以及孢子的形态、着生方式。（二）实验原理放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。图23 霉菌菌丝示意图A无隔多核

40、菌丝；B有隔单核菌丝；C有隔多核菌丝。霉菌(mold)是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝(hypha)构成。许多菌丝交织在一起称为菌丝体(mycelium)。菌丝在光学显微镜下呈管状，直径约为210m，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。霉菌菌丝有两类(图23)：无隔膜菌丝，整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加，如根霉、毛霉、犁头霉等。有隔膜菌丝，菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流

41、通，而且每个细胞的功能也都相同，如青霉菌、曲霉菌、白地霉等绝大多数霉菌菌丝均属此类。在固体培养基上，部分菌丝伸人培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空中生长，称为气生菌丝。有的气生菌丝发育到定阶段，分化成繁殖菌丝，即孢子丝。（三）实验材料1. 菌种灰色链霉菌，黑曲霉，毛霉。2. 实验器材显微镜，载玻片，盖玻片，接种针。（四）实验步骤实验步骤同实验一放线菌和霉菌形态观察。实验三 培养基的配制及灭菌培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源

42、、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定pH的范围内。迄今为止，培养基的种类极其繁多。按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其它天然有机成分配制而成的培养基。其优点是营养丰富、价格便易；缺点是成分不能准确确定且不稳定。实验室常用的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。合成培养基是指完全利用已知种类和成分的化学试剂配制而成的培养

43、基。优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价格较贵。实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基。半合成培养基是指由天然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基即为半合成培养基。按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂（常加1.52的琼脂）经融化冷凝而成；半固体培养基是指在液体培养基中加入0.21左右的琼脂，经融化冷凝而成；液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。按培养基的用途，可将培养基分为加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。加富培养基是指在培养基中加入某些特殊营养物质，促

44、使某种持殊性能的微生物迅速生长，有利从混合菌群中分离出所需种类微生物。例如为了分离能够利用石蜡的微生物，常在培养基中加入石蜡作为碳源。选择培养基是指在培养基中加入某些微生物生长抑制剂，抑制那些不需要的微生物的生长，以达到从混杂微生物菌群的环境中分离到所需的微生物。例如用于分离真菌的马丁培养基。鉴别培养基是指在培养基中加入特定指示剂，它能与某一微生物的代谢产物产生显色反应，便于微生物的快速鉴定。例如用于鉴定大肠杆菌的伊红美蓝培养基。本章着重介绍培养基的常规配制程序，培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌常用培养基的配制方法，以及几种常用选择培养基和鉴别培养基的配制方法。此外还介绍高压蒸汽灭菌法，它是微生

45、物学实验中最常用也是最重要的灭菌方法。 一、培养基的常规配制程序（一）目的要求 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项。了解培养基的配制原理。（二）基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。（三）实验材料 1. 药品待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液等。2. 仪器天平

46、或台秤、高压蒸汽灭菌锅。3. 玻璃器皿移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。4. 其它物品药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。（四）实验步骤1. 玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。详见附录一。纸条，宽5cm棉花移液管图31 单支移液管包扎方法2. 灭菌前玻璃器皿的包装(1) 培养皿的包装：培养皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或

47、者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。(2) 移液管的包装：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约11.5cm。塞棉花时，可用一外圈拉直的回形针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45角，折迭纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折迭打结

48、，准备灭菌(见图31)。3. 液体及固体培养基的配制过程1）液体培养基配制称量：一般可用1/l00粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。溶化：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积的溶液，加入到培养基中。调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪取一小段pH试纸，然后用镊子夹住pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaOH

49、或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2）固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.52)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。 4. 培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小

50、块脱脂棉或卷纸，擦去管口或瓶口的培养基。 1）试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内(图32)。图32 培养基的分装装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15150 mm时，液体培养基可分装至试管高度l/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中；用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/3(约10 m1)；半固体培养基分装量为管高的

51、1/3为宜。2）锥形瓶的分装用于振荡培养微生物用时，可在250m1锥形瓶中加入50m1的液体培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250ml锥形瓶中加入150m1液体培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。5. 棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。1）试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻

52、璃棒塞入，也可用折迭卷塞法制作棉塞(图33)。折角铺平卷成形图33 棉塞制作过程制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外(图34)。目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞，直接盖在试管口上，灭菌待用。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。2）锥形瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口上，既保证良好

53、通气，过滤除菌又操作简便，故极受欢迎。在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。图34 试管帽和棉塞1.试管帽；2.正确的棉塞；3.不正确的棉塞；4.不正确的棉塞 6. 培养基的灭菌 培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，121灭菌20 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。 7. 斜面和平板的制作图35 斜面的制作1）斜面的制作将已灭菌装有固体培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图35)。斜面长度为试管长度1/3，底层长为试管的2/3。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂

54、直放置至冷凝。2）平板的制作图36 平板的制作将装在锥形瓶或试管中已灭菌的固体培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。倒平板时，培养基温度过高，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1012 m1的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板(图36)。8. 培养基的无菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出12管(瓶)，置于37温箱中培养12d，

55、确定无菌后方可使用。9. 无菌水的制备 在每个250 m1的锥形瓶内装99 m1的蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5 m1蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，121灭菌20 min。（五）实验报告内容1. 简述移液管包装注意事项。2. 简述配制液体培养基的简单步骤。3. 简述斜面及平板培养基的制作过程。 （六）思考题 1. 为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞上一小段棉花，再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用？2. 为什么微生物实验室所用的锥形瓶口或试管口都要塞上棉塞，经高压蒸汽灭菌后才能使用？制作合格棉塞的标准是什么？3. 配制培养基时为什么要调节pH?4. 配制固体培养基时，需在液体培养基中添加多少量的琼脂？5. 将含琼脂的培养基分装至试管中应如何操作？注意事项是什么?6. 制作斜面培养基时，其斜面长度应相当于试管长度几分之几为宜？7. 制作平板培养基的注意事项是什么？8. 培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌?如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？9. 如何检查灭菌后的培养基是否无菌？