仪器分析在花色苷中的应用课件.ppt

1、仪器分析方法在花色苷研究中的应用,绪言,观赏植物的花色多种多样，花色主要是由花瓣中的色素类型决定，其中花的蓝紫色是由花色苷形成。在许多观赏性好、经济价值高的花卉中都缺乏蓝色系，如月季、香石竹、菊花等。因此，花色苷是目前花色研究的热点，内容涉及生化、生理和遗传学等多个方面。花色苷结构、性质的研究是花色苷研究的重要基础，本文主要介绍仪器分析方法在这项研究中的应用。,1 花色研究概况,色素的化学分析：类胡萝卜素、花色素苷、叶绿素、甜菜色素 花色变异机理 色素生物合成途径（基 因、关键酶） 分子育种改良花色,影响花色形成的主要因素,色素组成 助色素：黄酮醇、二氢黄酮等 金属离子：Al3+、Fe3+、M

2、g2+等 pH值 细胞结构和内环境,2 花色苷的化学结构和性质,2.1 花色苷化学结构 花色苷（anthocyanin）为黄酮类化合物，是由花色素和各种糖形成的配糖体。 花色素（anthocyanidin）是具有类黄酮典型结构的2-苯基苯并吡喃阳离子的衍生物，以 C6C3C6 为基本骨架，目前已知有20种花色素。 形成配糖体的主要的糖有：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、芸香二糖、龙胆二糖、槐二糖等。 花色素在3、5、7等位置与糖结合后形成糖苷，因此花色苷也相应地被分为单糖苷、二糖苷或三糖苷.,2.2 影响花色苷颜色稳定性的主要因素 花色苷的酰化作用： 有机酸如-香豆酸、咖啡酸和琥珀酸等通常与花色苷的3

3、、5、7或3位上的糖结合,形成单酰、二酰或多酰花色素苷。酰化花色苷参与分子内辅助着色或分子间辅助着色反应，是花色苷在较宽的pH值范围内颜色稳定表现。 pH值的作用： 在溶液介质中,花色苷会随pH有几种结构的变换。对于一个给定的pH值,在花色苷的4种结构之间存在着平衡:蓝色的醌式(脱水)碱、红色的花钅羊正离子、无色的甲醇假碱和查尔酮。 金属离子： 酰化花色素与辅助色素、金属发生反应,形成复合花色素苷。,研究的主要对象：羟基的位置和数量、糖的类型及位置、酰基化作用、取代基等 研究的主要方法：光谱法紫外可见光谱、红外吸收光谱，色谱法，核磁共振波谱法，质谱法,3 花色素苷的定性分析,3.1 光谱法,3

4、.1.1 紫外可见光谱法 紫外-可见光谱很早就被人们应用于花色苷的结构鉴定。该法主要有如下几点： 花色苷最大吸收波长一个在可见光区的500540nm附近，另一个在紫外275nm附近，通过测定色素的最大吸收波长即可判断是否为 花色苷类色素。 如果向花色苷的0.01%盐酸甲醇溶液中滴加35滴ll3甲醇或乙醇溶液,出现蓝移，即最大吸收波长增加，说明-环有邻位酚羟基，即可区分-环无邻位酚羟基的天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和-环有邻位酚羟基的矢车菊色素、牵牛花色素、飞燕草色素。,根据花色苷最大吸收波长处的吸光度和440nm处的吸光度的比值440/max，参考文献后，可以判断糖苷的位置。 根据花色苷在3

5、00330nm间有无吸收峰可判断该色素分子是否有酰基，如果有吸收峰，表明该色素有酰基存在。 根据花色苷在440nm处是否有肩峰，可以判断该色素5号位的羟基是否被取代。如果5号位的羟基没有被取代，则该色素在440nm处有肩峰。 根据花色苷在紫外光下是否有荧光，可判断该色素是否在5号位有取代基，如果有荧光则表明该色素在5号位有取代基。,3.1.2 红外吸收光谱 目前,红外吸收光谱应用于花色苷的结构鉴定不太广泛。花色苷的红外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基和甲氧基四部分。 其中杂环的CO键的吸收峰在1630-1620cm-1，苯环和杂环的C一C键有三个吸收峰：1605-1580cm-1， ：157

6、7-1565cm-1，：1518-1485cm-1 。苯环C-H键的吸收峰在900-800cm-1，4-H:905885cm-1，6-H:839-848cm-1，8-H:809一830cm-1。B环C-H键的吸收峰位置受取代基影响，不同的苷原也不相同。甲氧基和经基的吸收峰在1120-1010cm-1。花色苷的乙酞化产物的C=O键引起的峰在16541695cm-1。,3.2 色谱法,利用色谱法进行花色苷的结构鉴定需要对花色苷进行酸水解、碱降解和过氧化物降解等处理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有机酸游离出来，再通过标准的糖苷配基、糖和有机酸作对照或参考文献数据,进行色谱分析。 各样品的分析方法主要有

7、：微晶纤维素薄层层析法(CellucoseTLC)，纸层析，HPLC，分析糖类时还有采用衍生化气相色谱法的报道，RP-HPLC应用于花色苷结构鉴定也逐渐多了起来。,3. 3 核磁共振波谱法,核磁共振技术是有机结构鉴定的重要手段之一。在分子生物学，药物化学，植物化学等诸多方面有广泛的应用。应用于花色苷的分析从二十世纪七十年代末已经开始了。常用的有，1H一NMR和13C一NMR谱法。 花色苷在不同pH值条件下，会发生结构的变化，在酸性环境中呈钅羊盐离子态时较容易测定，所以常用以下溶剂：CD3-TFA-d(氘代甲醇-三氟醋酸)，DMsO-d6-TFA(六氘代二甲亚砜-三氟醋酸)，D2O-DCI(重水

8、-氘代氯化氢)，CD3OD-DCl。 各质子的信号范围：苷原9-6ppm，糖中半缩醛的质子6-4.5ppm，HC=HH7-6ppm，大多数糖的质子在4-3ppm。,3.4 质谱法,质谱是二十世纪初发展起来的物理分析方法。在一定条件下能对复杂的有机物给出确定的，可以重复的质谱图，由分子的断裂规律得到许多的结构信息。FAB(Fast AtomBombardment)是八十年代发展出的新离子源，多采用惰性气体，如氢，氘等中性原子流轰击样品使之离子化。FAB一MS具有较高的灵敏度，适用于分析极性大分子量较大的化合物。在花色苷的研究中主要用于花色苷的分子量的确定。,4 花色素苷的定量分析,4.1 含有很

9、少或者不含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定： 花色苷的最大吸收区在500550nm范围内，而离这一范围最近的类黄酮的最大吸收范围在350380nm。在新鲜的植物提取物中，因为很少含有在花色苷的最大吸收区发生吸收的干扰物质，花色苷总量可以利用比耳定量通过适当波长处的吸光度来测定。 该方法测定花色苷总量需要在一个恒定的pH介质中进行。除了需要在定性的基础上确定花色苷的种类，还需要测定单个花色苷的最大吸收波长下的摩尔消光系数或比消光度。又因为单个花色苷的差别很小，而且单个花色苷组成的比率未知，所以一般用平均比消光度avE来测定花色苷总量，误差小于0.2%。但是，单个花色苷的比消光度E是很难得到的，

10、所以我们可以参考文献提供的数据。,4.2 含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定： 4.2.1 pH示差法：该法依据之一是花色苷发色团的结构转换是pH的函数，依据之二是超干扰作用的褐色降解物的特性不随pH而变化。通过实验，确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，根据Fuleki的公式可以计算出花色苷总量。 4.2.2 差减法：差减法就是先测定样品在可见光区最大吸光度，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后，再测定一次吸光度,二者的差值就是花色苷的吸光度。参考用标准花色苷绘制的工作曲线，将吸光度换算成浓度。但是，差减法因所使用的漂白剂也能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷浓度偏

11、高。 4.3 单个花色苷的定量： HPLC是广泛使用的方法。,5 其它应用,细胞pH值的测定 花瓣颜色的判定,5.1 花瓣细胞pH值测定,主要方法：荧光探针法、电化学法、核磁共振波谱法,原理：荧光探针强度随pHi升高呈线形变化 主要的荧光探针：SNAFL、BCECF、NERF等 方法：荧光比值法 优点：操作方便、对于细胞损伤小 应用：Asen等人于1975年应用这一方法对二百余种植物的花进行了细胞pH值的测定,5.2 颜色的分析,乳白玻璃投射法（Satio，1967） 积分球法(Yasuda，1967) 显微分光光度计法（Asen，1971）,颜色测定实例,八仙花花瓣的反射光谱的测量 新鲜的花

12、瓣切成1010mm2，固于一个盖玻片上，然后放在一个BaO白板上。将此板放在JASCO Ubest55分光光度计的一个积分球装置上，记录400800nm的反射光谱。 八仙花细胞原生质体可见光谱的测量 将200l原生质体悬浮液倒在聚赖氨酸预包裹的盖玻片上（1818mm2），在室温下放置1min，去除悬浮缓冲液后，将盖玻片放于一个塑料盘中（35mm）并加入2ml储存缓冲液（根据实验需求，KCl的浓度在0.1mM和10mM之间变化）。然后将其放在装有显微分光光度计（MCPD7000；Photal）的显微镜（IX70；Olympus）下观察，在直径10m的光学光束条件下，测量有色原生质体在可见光区（4

13、00800nm）的吸收光谱。 (K. Youshida,2003),6 花色苷国内外研究实例,结束语,仪器分析技术在花色苷研究中具有很重要的作用。随着分析技术的不断发展，目前的趋势是多项技术的结合以提高实验的精度。从而更准确的解释花色形成的化学机理，为花色分子育种提供理论依据。,主要参考文献：,安田齐.(1989)花色的生理生化.中国林业出版社，北京 李景琳,李淑芬,潘世权. （1993）高粱红色素的主要成分及结构分析.辽宁农业科学,5:47-49 王常青.（1996）黄刺玫色素的提取及其性质的探讨. 食品与发酵工业，6:36-38 谭仁祥.(2002)植物成分分析.北京-科学出版社:486-

14、501杨少勇，安银岭等.(2003)蓝色花植物花色素的着色机理.北京林业大学学报，25（5）:68-75 姜平平，吕晓玲，朱惠丽.（2003）花色苷类物质分离鉴定方法.中国食品添加剂，(4):108-111 徐清燏，戴思兰.（2004）蓝色花卉分子育种.分子植物育种，2（1）：93-99 卢钰，董现义等.(2004)花色苷研究进展.山东农业大学学报(自然科学版)，35(2):315-320 T. Kondo. et al. (1992) Structural basis of blue-colour development in flower petals from Commelina communis. Nature，358:515-518 Toki K.，et al. （1994） An acylated delphinidin glycoside in the blue flowers of evolvulus pilosus. Phytochemistry，36:609-612 Yoshida K.，Toyama Y.，et al. （2000） Contribution of each caffeoyl residue of the pigment molecule of gentiodel