碱性磷酸酶km值测定.ppt

1、酶促反应动力学研究方法介绍,EXPERIMENT 3,碱性磷酸酶km值测定,实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值； 实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,相关E学原理,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式( Michaelis equation)。,S：底物浓度 V： 不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏

2、常数(Michaelis constant),米曼氏方程式推导基于两个假设： (1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 Vk3ES。 (2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。,推导过程,稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定。 K1 (EtES) SK2 ES + K3 ES,则(2)变为: (EtES) S Km ES,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EtES，反应达最大速度 VmaxK3ESK3Et (5),将(5)代入(4)得米氏方程式：,当反应速度

3、为最大反应速度一半时,Km值的推导,KmS,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,（二）Km与Vmax的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,意义：Vmax=K3 E 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。,定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的

4、分子数。 意义 可用来比较每单位酶的催化能力。,酶的转换数,（三）m值与max值的测定,双倒数作图法(double reciprocal plot),Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 E,双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。,* 低温的应用,pH对反应速度

5、的影响,最适pH (optimum pH)： 酶催化活性最大时的环境pH。,碱性磷酸酶km值的测定,以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件下(pH=10.0，37)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： 然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。,1酚试剂 22.5mmolL磷酸苯二钠基质液 3碱性缓冲液(pH-10.0) 4碱性磷酸酶液,【试剂】,称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。,称取无水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3.36g，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。,称取碱性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。,操作,混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。,实验数据及结果,以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的