细胞融合和体细胞杂交

1、第五章细胞融合与体细胞杂交、远源杂交、远缘杂交：不同属间或地理上远缘的种内亚种间个体的杂交称为远缘杂交。 由于种间存在各种隔离机制，远亲杂交常表现为非亲和或获得的远亲杂种不育。 不亲和性：在有性生殖过程中，由于个体细胞和组织水平的不整合，受精和结合不能正常进行，或受精后不产生子孙的现象。 父母个体间的基因型不匹配或染色体群的非同源性对生殖生理表型的反映。 不亲和性是稳定物种的重要机制。 种间不亲和性：异种、异属生物个体间的生殖不亲和性现象多由染色体群的不同所致。 一般来说，越是远缘不亲和性越高，直到完全不能受精为止。 第六章细胞杂交(融合)技术一、定义一、细胞融合(cell fusion )广

2、义：将两个细胞或原生质体融合为一个细胞的过程。 包括体细胞性细胞融合和自发融合。 关于植物，也被称为原生质体融合(protoplast fusion )。 狭义：希望有一种通过融合不同体细胞、筛选、培养杂种细胞来获得体细胞杂种的手段。 因此也被称为体细胞杂交(somatic hybridazation )。 细胞融合=原生质体融合=体细胞杂交，体细胞杂交和有性杂交的异同，第二节体细胞杂交步骤： 1原生质体的调制2原生质体的融合3杂种细胞选择4杂种细胞培养5愈伤组织再生植株6杂种植株的鉴定、原生质体融合、自发融合：自然界在受精、双受精、花粉母细胞融合原生质体制的准备和培养过程中， 细胞壁分解后，

3、原生质体的细胞间连线膨大，邻接细胞的原生质和细胞器通过细胞间连线流动，形成融合。 该现象发生在同种或同品种的植物之间，但频率极低。 诱导融合：在诱导剂的作用下，融合两个远缘原生质体的方法有细胞融合常用的手段、细胞融合的方法、聚乙二醇PEG、化学方法、仙台病毒(Sendai virus )、NaNO3处理的缺点：异核体形成频率不高，细胞污染大高ph高浓度钙离子处理1973年，Keller和Melchers用强碱性(pH10.5 )高浓度钙离子(50mmol.L-1 )溶液处理约37分钟，两品种系的烟叶肉原形质体非常好，但有些PEG (聚乙二醇)处理PEG的作用机理：由于PEG分子具有轻微的负极性

4、，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成h键，在原生质体之间形成分子桥，结果使原生质体粘着促进原生质体的融合。 此外，PEG还能增加脂质膜的流动性，使原生质体的核细胞小器官融合成为可能。 PEG融合所需的试剂、融合液： ph 5.6 CaCl 28-10 mmol kh2po40.7 mmol甘露醇或山梨糖醇0.5-1.0mol诱导液：融合液PEG 2045，PEG作为融合剂的优点：异核体形成的频率高，再现性强。 缺点：具有一定的毒性，容易形成多个细胞的融合体，分裂频率低。 通过电融电场诱导细胞之间的连接，瞬间施加强脉冲，促进质膜的可逆电击着，促进细胞融合的技术。 原理：在直流脉冲的刺

5、激下，原生质体质膜表面的电荷发生变化，使异种细胞或原生质体结合，使质膜瞬间破裂，进一步连接，形成融合体直至完整的膜。 优点：融合率高，重现性和可控性强。 缺点：可能引起无法恢复的细胞损伤。 细胞电融合器、生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是病毒与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就能打破两个细胞膜的间隔，引起细胞质的交流，达到细胞融合的目的。 缺点：必须尽早培养大量病毒，并在灭活后作为融合剂使用，操作复杂，而且灭活不充分时，病毒也可能感染亲本细胞。 因此，现在使用病毒诱导法的细胞融合很少。 (1)充足量的病毒粒子附着在细胞膜上作为桥梁，收集细胞。 (2)通过病毒和原生质

6、体或细胞膜的作用使两细胞膜之间相互渗透，使细胞质相互融合。 粘结部位的质膜被破坏，在不同的细胞之间形成通道，细胞质流通融合(病毒也进入细胞质)。 (3)有丝分裂、细胞核融合、杂种细胞形成。 在原生质体融合过程中，异质体首先经膜融合形成共同的质膜，然后经细胞质融合产生细胞壁，最后是核融合。 细胞核融合是异种原生质融合的关键。 融合体只有成为单核细胞才能继续生长，合成DNA、RNA，四异核体的核聚变一般发生在双亲本核的同步分裂过程中，双亲本核的发育周期的同步度和系统发育关系的远近以及培养基对双亲本核的有利度1异核体的核聚变和染色体的行为。 第一次有丝分裂，这要求两核必须同时分裂，如果两核所处的时期

7、不同，一方开始合成DNA，另一方还在合成过程中或复制完成后，它们之间会相互影响，最终不能进行细胞分裂。 2亲缘关系对融合体发育的影响种内和亲和的种间：非亲和属间、科间：核融合失败、染色体缺损、位错或嵌合体形成。 属间可以成为植物，但不育。 海藻胡萝卜首次分裂后，亲本核退化。 Hela胡萝卜，胡萝卜核退化。 细胞融合是一个随机的物理过程，融合的细胞以多种形式出现，需要通过培养和筛选去除不需要的细胞，分离必要的杂种细胞，解决融合细胞的选择问题。 问题：在a和b融合过程中，有哪些形式的细胞可以选择融合体或杂种细胞，1 .互补选择法，2 .机械分离杂种细胞法，3 .双荧光标记选择法，异硫氰酸荧光素(F

8、ITC ) :绿色异硫氰酸若丹明(RITC ) :红色，双荧光体细胞杂种形态标记简单直观，但标记少，多态性差，易受环境条件和其他修饰基因的影响，且许多性状为数量性状，受几个部位控制，表达为一个范围，不是简单的性别差异。 细胞学标记、细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(c带、n带、g带等)。 由于细胞学标记位点较少，而且亲缘关系相近的种类细胞学标记差异不明显，难以根据细胞学特征进行区别。 荧光原位杂交(FISH )更准确、直观，因为它可以显示体细胞杂种的哪条染色体来自该亲本，哪条染色体来自另一个亲本。 分子生物学标记、植物的分子标记主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。 克服体细胞杂交育种的意义