第十一章-微生物培养检验技术.ppt

1、第十一章食品微生物培养检验技术,（补充章节）,食品的特点,1、有丰富的营养物质 微生物进行正常的生理活动和生长繁殖,首先要有适当的营养条件,如碳源 氮源 无机盐类和生长素,碳源是构成菌体成分重要元素 2、含有一定量的水分 菌体所需的营养物质要成为水溶液状态才能被吸收 3、常具有天然防御结构和抑菌物质,食品微生物来源及污染途径,食品微生物来源：土壤、空气、水、人和动物 土壤 粮食、蔬菜和水果等植物性食品最易受到土壤中微生物的污染。以细菌最多，其次是放线菌、霉菌与酵母菌。 空气 在空气中，有时会出现一些病源微生物，如结核杆菌和金黄色葡萄球菌等病原菌，可通过污染的食品而引起感染。 水 水是一种污染源

2、，淡水中常见的微生物类群有：假单胞菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属等菌种。海水中主要是副溶血弧菌，是人类吃海产品而引起食物中毒的病原菌 人与动植物 人与动植物体表、人与动物的消化道和上呼吸道均有一定种类的微生物丛存在，该微生物如果污染了食品，常引起腐败变质。当人与动物有致病微生物侵入机体而致病时，体内的病原菌就会随粪便和分泌物排出体外，如处理不当，直接或间接污染食品，造成对人的危害 工具与容器 ,微生物危害,美国，每年约有7200万人发生食源性疾病，造成3500亿美元的损失 80年代，上海，毛蚶，甲型肝炎爆发，累及30万人 1999年，宁夏，沙门氏菌污染肉品，食物中毒暴发，发病人数上千人

3、 2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌造成177人死亡，中毒人数超过2万人,采样：指从待检物中采取少量具代表性的样品供分析检验用。 样品种类 样品种类可分为大样、中样、小样三种。大样系指一整批，中样是从样品各部分取得的混合样品，小样系指做分析用，称为检样。检样一般以25g为准，中样以200g为准。 采样用具： 如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子和开罐器等，必须是灭菌的。 一、采样要求 1、采样前，准备好灭菌的容器及采样工具。 2、无菌采样 3、用无菌纸袋或玻璃器皿存放样品 4、样品及时封口，并做好记录 5、及时送检,样品的采集,二、采集方法 采样原则： 能采取完整包装的样品就

4、不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样。 根据样品种类如袋、瓶和罐装者，应取完整的未开封的； 如果样品很大，则需用无菌采样器取样； 样品是固体粉末，应边取边混合； 样品是液体的，通过振摇即可混匀； 检样是冷冻食品，应保持在冷冻状态(可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存)，非冷冻食品需保持在05中保存。,1、面包、糕点、方便食品 采集方法：取原包装，用无菌镊子夹下包装纸采取外部及中心部位检样共200g，带馅糕点直接采取外皮与内陷25g。 检样处理：无菌称检样25g，加入225ml无菌生理盐水中制成菌悬液。 2、豆制品 样品采集：采取接触盛器边缘、底部及上面不同部位样品200g放入

5、灭菌容器内。 检样处理：无菌称样25g，放入225ml无菌水中混匀。,3、乳及乳制品 样品采集 散装或大型包装：用灭菌刀、勺取样，每件不少于200g，及时送检。 大型包装：采用整件原包装，每件样品采集量为 瓶装：1瓶 袋装：1袋 罐装：1罐 检样处理 鲜奶、酸奶：无菌手续去纸盖，瓶口火焰消毒后无菌吸取25ml，放入225ml无菌生理盐水中混匀。 炼乳：将瓶或罐用温水洗净，用点燃的酒精棉球消毒，无菌开罐器开瓶后，无菌称25g(ml)放入225ml无菌生理盐水中混匀。,奶油：无菌开包，取适量于灭菌三角瓶内,45水浴溶解（温箱），立即吸25ml225ml生理盐水中十倍稀释（45水溶中保温）。从检样融

6、化到接种完毕不应超过30分钟。 奶粉：罐装的同炼乳。袋装的用75%酒精棉球涂擦消毒袋口，无菌开封取样25g，放入含玻珠的三角瓶中,将225ml温热生理盐水徐徐加入，防结块。 奶酪：用灭菌刀削去部分表面封蜡，再用点燃的酒精棉球消毒表面后，用灭菌刀切开后，用无菌刀取表层及深层检样少许，置灭菌乳钵内捣碎，加少许生理盐水调成糊状。,4、蛋及蛋制品 样品采集 鲜蛋：用流水冲洗外壳，再用95%酒精棉球涂擦消毒后，放入灭菌袋内，加封作好标记送检。 全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：将包装开口处用75%酒精棉球消毒再开盖，用灭菌的金属制双层螺旋式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋转收取检样，提出箱外用灭菌小匙自上、中、下

7、部取样，装入灭菌广口瓶中，每个检样不少于100克。 检样处理鲜蛋外壳 用无菌生理盐水浸湿的棉拭充分擦试蛋壳，将棉拭直接放入培养基内增菌培养。 将整只鲜蛋用无菌水擦洗，以擦洗液作检样。 鲜蛋蛋液：蛋壳流水下洗净75%酒精消毒壳打蛋 蛋粉：装样瓶浸入流动冷水中，检样融化后取出放入有玻珠的瓶中。,5、肉及肉制品 肉类包括鲜肉、冻肉、肉馅、禽肉等，肉制品指火腿、香肠等。 样品采集 生肉：宰后用无菌刀取两腿内侧肌肉各500克或劈半后两侧背最长肌各50克，立即送检。 家禽：用灭菌棉拭采胸腹各10cm2，背10cm2，四边各5cm2 其他熟制品：一般采200克。 检样处理 生肉：表面消毒（沸水内烫34秒或烧

8、灼消毒）无菌剪取检样深层肌肉25克灭菌乳钵内剪碎无菌玻璃砂研磨加灭菌水225ml 熟肉、灌肠、肉松：直接称25克放入灭菌乳钵内无菌剪碎研磨加225ml无菌水 棉拭液：凡用棉拭采取的检样作原液，摇匀后10倍稀,6、调味品 样品采集 酱油、食醋：瓶装 采取1瓶 散装 无菌吸500ml 酱类 用灭菌勺子取500g 味精 采取一袋100g 检样处理 瓶装：酒精棉球消毒瓶口石碳酸纱布盖好灭菌开瓶器开启检验 散装：直接吸取接种 酱类：无菌称25g225ml无菌水,7、冷食品 样品采集 冷食菜：将样品混匀，采样200g 瓶装饮料：2瓶为一件 散装采500ml 冰淇凌：4杯为一件 散装采200g，放瓶内冷藏或

9、隔热容器中 食用冰块：食用冰块取500g 检样处理 冷食菜：25g+225ml无菌水中 瓶装饮料：点燃酒精棉球烧瓶口石碳酸纱布盖好无菌开盖,采样标签的填写,采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚： 编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。,样品的微生物检测方法 一、感官检验 1、色泽 微生物菌体本身的颜色。 微生物分泌的色素。 微生物的代谢产物促使食品发生化学变化。 2、气味 不正常的气味产生，如霉味臭、乙酸臭、胺臭、粪便臭、硫化氢臭、酯臭等 。 3、口味 从口味的改变上反映出来如 酸味、苦味及其它异味。 4、组织状态 固体食品

10、：变形、软化、发粘、结块、湿润。例如鱼肉因微生物作用使组织细胞破坏，细胞内容物外溢而呈现肌肉松驰、弹性差，有时表面发粘。 液体食品：浑浊、沉淀、浮膜、变稠、产气。,二、样品的微生物镜检 直接对样品进行镜检。 三、培养检验 （一）培养基的选择 细菌 肉汤蛋白胨培养基 酵母 用酵母菌培养基 霉菌 用霉菌培养基并加入细菌抑制剂（孟加拉红70mg/100ml或链霉素4000g/100ml） 放线菌 用高氏一号培养基,（二）培养检验方法 1、种植培养 （1）方法：适用于粒状或块状试样的全菌和内部菌分析 直接种植培养 适于全菌分析。样品不做任何处理，直接点植于平板培养基上。 表面消毒种植培养 适于样品的内

11、部菌分析。,（2）注意事项 用无菌镊子夹取样品均匀种植在培养皿上，微压。 种植数 9-11cm培养皿 5点或10点 块将样品切成1cm20.1-0.5cm,每皿3-5块 贴标签，注明样品名称、日期、分析方法、培养 细菌 32 12天；霉菌28 57天 结果分析 计算菌的检出率； 某菌检出率=检出某菌的点数/种植培养总点数 记录培养特征； 镜检形态特征,2、稀释培养 适用于菌量分析：外部菌、内部菌及全菌 （1）方法 洗涤稀释 适于粒状或块状样品外部菌分析 混合稀释 适于粉状或流体试样的全菌分析 捣碎稀释 用组织捣碎器或研钵将定量无菌水捣碎，试样经表面消毒后也可作内部菌分析。 （2）菌落计数 菌落

12、计数时限 细菌 定温培养12天 酵母 23天 霉菌 57天,稀释度选择 试用三个连续稀释度，每稀释度做24套平行平板。 一般试样：细菌检测用10-2、10-3、10-4 真菌检测用10-1、10-2、10-3 计数平板选择 选用同一稀释度各皿的平均菌落数，细菌30300间，真菌10100间。 报告 含菌量（单位重量或体积）=平均菌落数稀释倍数取样量（采用二位有效数字）,样品的微生物学检验项目 一、细菌学检验 （一）菌落总数的检测 菌落总数：菌落数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。 1、细菌总数的意义 常作判定样品被微生物污染程度的指标。 预测样品

13、耐存放的程度和期限。 细菌越多，菌相越复杂，污染致病菌的机会越多。 2、细菌总数的检测方法 检样称取（25克+225ml+玻珠）稀释（十倍稀释）平皿滴加（选用三个连续的稀释度）培养基的平皿倾注（45-5010-15ml）培养（37倒置24-48小时）菌落计数报告,（二）大肠菌群及其卫生学意义 大肠菌群指一群37下24小时内能发酵乳糖产酸产气、好氧或兼性好氧的G（-）无芽孢短杆菌。 卫生学意义 作为理想的粪便污染指示菌，它具备 A肠道内特有，显示指示特性 B肠道内数量大，易检出 C肠外环境中抵抗力强 D少量存在也能检出 2、检验方法 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表报告大肠菌群的近似数MPN(

14、100ml或100克样品中Most probable Number) EMB平板上大肠菌群菌落特征：深紫黑色、黑紫色、淡紫红色。,（三）致病性细菌的检测 主要指一些能引起人类食物中毒的细菌，主要有：沙门氏菌、病源性大肠杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。食品卫生法中规定，这四种致病菌不得有检出。 目前，对样品中病原菌进行检验还存在一定的局限性。因借一种或少数几种检验方法无法将多种病原菌全部检出，而采用较多的检验方法在实际工作中又不现实。同时样品种类多，所处的环境条件不一，污染致病菌的种类和数量也不一样。但多数情况下，污染的病原菌数量不会太多（对环境的抵抗力弱），一般检验难以检出，故进行致病

15、菌检验时只能根据食品的特点选一些致病菌作重点检测对象。,病源性大肠杆菌,琼脂平板 是边缘光滑，湿润，透明，粘稠的圆形 伊红美兰培养基：呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。,肉毒梭状芽孢杆菌的检验,最严格的厌氧菌。 普通琼脂上形成灰白色，半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。 血液琼脂上菌落周围有溶血区； 卵黄琼脂平板上生长时，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样薄层。G型没有,金黄色葡萄球菌的检验,样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。

16、增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白肉汤中，37C培养24小时。 分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37C培养24-48小时。 金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。 在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。 染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1m。,血平板,Baird-Parker平板,蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等 水产品海产品：链球菌、副

17、溶血性弧菌 乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌 畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌 米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等 罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌,二、真菌学检验 （一）霉菌的测定 1、稀释培养法 测全菌 固样捣碎稀释 粉样、流体样混合稀释 2、显微镜直接镜检法 血球计数器计数法 视野计数法 吸管、载片、盖玻等彻底消毒，用吸管准确测出1ml菌液的滴数，并滴一滴于载玻片上，盖盖玻片（菌液不外溢或发生气泡），在显微镜下按下列顺序检视10个视野，记录每个视野菌数，求出平均数，再用测微尺测定视野直径，求出视野面积，同时算出盖玻片面积，则： 每克样品带菌量=C/R.M.L.D/W,(二）酵母菌总数的测定 1、稀释法 混合稀释、捣碎稀释 2、镜检法 血球计数板计数法、视野计数法,三、其他微生物检验 微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等； 另外，从食品检验的角度考虑，寄生