分离纯化的前期步骤.ppt

1、第八章生化物质的制备和分离纯化、生化物质的制备和分离纯化、分离纯化的一般步骤选择细胞球破碎提取分离纯化结晶纯度鉴定保存、8.1分离纯化的一般步骤、选择细胞球破碎提取分离(沉淀法、离子交换法)纯化(分子筛、阳离子电泳)结晶纯度鉴定保存， 分离纯化某些特定蛋白质的一般工艺为了分离纯化某些蛋白质，首先要求将蛋白质从原来的组织或细胞球中以溶解的状态释放，保持原来的天然状态，不丧失生物活性。 第二步是“粗分类”(rough fractionation )。 得到蛋白质混合物提取液后，用适当的方法分离所希望的蛋白质和其他杂蛋白质。 该步骤的分级采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等方法。 第三步是“细分

2、级别”(fine fractionation )，即样品的进一步纯化。 样品经粗分级后，一般体积小，杂蛋白大部分被去除。 进一步精制中，作为一般使用的色谱分析法，有凝胶过滤、离子交换色谱、吸附色谱法、亲和色谱法等。 如果需要，也可以选择电泳法。 8.2材料的选择和处理，含量高容易得到干扰物质，价格便宜容易分离的安全性好，除去杂冻干燥浓缩，选择材料，含量高容易得到干扰物质，价格便宜安全性好，提取工艺简单有综合利用价值，微生物、植物和动物都制造蛋白质对于微生物，应注意其生长期，在微生物的对数生长期，酶催化剂和核酸的含量高，可得到高产量，以微生物为材料时， (1)有微生物菌体被培养基分泌细胞的代谢产

3、物和胞外酶等。 (2)利用菌体所含的生物化学物质，例如蛋白质、核酸、胞内酶等。 植物材料要去壳脱脂，注意植物品种和生长状况的差异，其中所含生物大分子量变化很大，且与季节性有密切关系。 对于动物组织，以有效成分含量丰富的脏器组织作为产品材料，必须先进行挤压、脱脂等处理。 此外，对于预处理过的材料，如果不立即进行实验则冷冻保存，对于容易分解的生物大分子则使用新鲜的材料进行调制。 8.3细胞球破碎、(1)磨粉机法/组织斯坦共和国法(2)医学超声破碎法(10-15KHz) (3)渗透压法(高渗透或低渗透处理) (4)冻融法(5)界面激活剂处理法(ss通常的高速组织碎石机、细胞球均质器，也可以使用微生物

4、细胞破碎专用的细菌磨等。 (2)医学超声破碎法采用特异的医学超声破碎器，利用机器产生的医学超声(1015kHz )的机械振动后对组织细胞的空化作用作用破碎细胞球。 对动物材料的效果优于微生物材料和植物材料。 (3)渗透压法(高渗或低渗透处理)，渗透压是对抗渗透趋势所必需的力。 将细胞球放入高渗溶液(如蔗糖溶液)使其有会儿平衡后，放入突然地低渗透缓冲液和水溶液中，细胞贴壁会因渗透压的急剧变化而破碎。 该方法只适合处理细胞贴壁相对脆弱的细胞球。 (4)冻融法：将细胞球在低温(-15 )下冻结后，在室温下熔化，可以反复多次使细胞贴壁破裂。 该方法也适用于细胞贴壁易破的细胞球。 (5)界面激活剂处理方

5、法：在适宜的温度、pH值和低离子力下，界面激活剂(如SDS、Tween、TritonX )与脂蛋白形成微气泡，能使膜的渗透性发生变化或溶解。该方法对膜结合的酶催化剂的提取相当有效，但对其他蛋白质容易变性，也有切断肽链的情况。 (6)利用细胞球自溶法、细胞球自身的酶催化剂；(7)丙酮法(冷丙酮脱水提取)、丙酮等脂溶性溶剂溶解胞质膜上的脂质化合物，破坏胞质膜的结构。 一般将细胞球制成丙酮干粉后，加入萃取酶催化剂。 (8)酶催化剂处理方法，用外来的溶血工作团队和细胞贴壁分解酶催化剂(如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等)，在某条件下作用于细胞球上，使细胞贴壁破碎。 但是，该方法需要添加酶制剂，因此可能不利地影

6、响后续目标酶催化剂的提取。8.4萃取、物质萃取始终配合细胞球破碎工艺，基于萃取物质的溶解特性，选择合适的溶剂始终保持低温操作，防止生物活性物质变性萃取的原则是对去除干扰作用物质、防止水解作用酶催化剂作用添加一定保护试剂的其他影响因素： pH、 溶剂极性和离子力等蛋白质(包括酶催化剂)的提取大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液中，与脂质结合的少数蛋白质可溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此可以使用不同的溶剂提取分离纯化蛋白质和酶催化剂(1)水溶液萃取法、无机盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质的最常用溶剂，通常用量为产品材料体积的1-5倍，提取时需要均匀搅拌，有利于

7、蛋白质的溶解。 提取的温度因有效成分的性质而异。 另一方面，大多数蛋白质的溶解度随着温度上升而增大，因此温度高则有利于溶解，提取时间缩短。 另一方面，如果温度上升，蛋白质的变性就会失活，因此从这一点可以认为提取蛋白质和酶催化剂时一般采用低温(5度以下)操作。 可添加蛋白水解酶阻化剂(例如二异丙基氟磷酸、碘冰乙酸等)，以避免蛋白质提取过程中的分解。 着重研究了提取液pH值和盐浓度的选择。 1、pH蛋白、酶催化剂是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。 用稀酸或稀碱提取时，可以防止过酸或过碱引起的蛋白质解离性化学基的变化，导致蛋白质构象的不可逆变化，通常，盐化学基

8、性蛋白质用偏酸性提取液提取，酸性蛋白质用偏盐化学基性提取液提取。 2、盐浓度低的浓度能促进蛋白质的溶解，被称为盐溶解作用。 由于云同步中的无机盐溶液具有盐络离子与蛋白质部分结合，所以蛋白质难以变性的优点，所以在提取液中加入少量NaCl等中性盐，通常为0.15摩尔。 提高浓度比较好。 缓冲液经常使用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗透盐溶液。 萃取缓冲液的选择需要以适当的pH值和离子力添加稳定剂。 例如，添加巯基乙醇、DTT、甘油、蔗糖、六乙二醇等金属络离子和络合剂。 例如，在Mg、EDTA等中添加蛋白酶抑制剂。 例如DPF (磷酸二异丙基氟)、(二)有机溶剂萃取法、与脂质的结合比较牢固或者

9、分子中的非极性侧链多的蛋白质与酶催化剂、水、无机盐溶液、稀酸或者不溶于食盐化学基，可以使用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具有一定的亲水性，也有强的亲脂肪丁醇萃取法特别优于与脂质结合提取紧密蛋白质和酶催化剂。 一是丁醇的亲油性强，特别是溶解磷脂复合物的能力强，二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内(度10%、40度6.6% )不发生酶催化剂的变性失活。 另外，丁醇萃取法的pH和温度选择范围广，也适用于动植物和微生物材料。8.5一次分离技术主要根据各物质的各物理化学性质的不同和对分离纯化物质的要求，采用相应的分离纯化方法采用溶解度不同的分离方法：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、PEG沉淀法，分

10、子尺寸不同的分离方法：透析/超滤、分子筛、 离心法分离离子交换色谱、电泳法，分子吸附法分离色谱分析法、亲和色谱法、沉淀技术透析/浓缩技术色谱分析法技术阳离子电泳技术，8.5.1沉淀分离方法， Dextran (右氰苷类) polyvinylpyrrolidine (乙烯聚合物) acetone (丙酮) polyethyleneimine (聚乙烯管亚胺) protamine (鱼精蛋白) strepine (1) 如果用粗分离技术沉淀的蛋白质的不变性沉淀不能完全加入酸/碱，则必须搅拌慢，防止局部的过酸/碱目的地的杂蛋白质或核酸等的电沉淀方法与盐析法或有机溶剂沉淀方法并用。 单等电点法主要用于

11、去除远离等电点的杂蛋白。 (2)盐析法、盐析、盐析、原理： lgS=- Ks * I I=CZ2/2:主要取决于蛋白质的性质和溶液的温度和pH Ks :主要取决于盐的性质。 Ks越大，盐析效应越高，影响因素、蛋白质自身因素：不同蛋白质发生盐析的条件也不同。 例如血浆蛋白盐析(Ks阶段盐析)蛋白质盐析时硫酸铵饱和度纤维蛋白原20%、优球蛋白33%、类球蛋白40%、白蛋白62%、影响因素、中性盐种类和离子力lgs I=1/2 CZ2硫酸铵金属钍硫酸铵浓度(饱和度)的纠正与调整， 蛋白质盐析中常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸纳金属钍、氯化纳金属钍、磷酸纳金属钍等。 其中使用最多的硫酸铵具有温度

12、系数小、溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M，即767g/升)的优点，0度时的饱和溶解度为3.9M，即676g/升)，在该溶解度的范围内，很多蛋白质和酶催化剂硫酸铵溶液的pH总是在4.5-5.5之间，用其他pH进行盐析时，需要用硫酸、试剂氨水等进行调节。 影响因素，温度：除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)下操作外，还可以在室温下进行。 一般温度低，蛋白质的溶解度降低。 但是，某些蛋白质(如血色素、肌红蛋白、白蛋白)在高温(25度)时溶解度比0度低，容易盐析。 影响因素为，PH:的多种蛋白质为等电点，在浓盐水溶液中的溶解度最低。 在一定的PH和温度条件下，改变离子力的盐析称为Ks级盐析，在一定的

13、盐和离子力条件下，改变PH和温度的盐析称为级盐析，影响因子、蛋白质浓度越小越好，一般为2.5 3%。 蛋白质浓度高的话，想要分离的蛋白质和其他蛋白质一起沉淀的情况很多(共沉淀现象)。 因此，盐析前血清加入等量生理盐溶液稀释，蛋白含量为2.5-3.0%。 实际操作时的注意事项是，在硫酸铵的纯度高的小试验或资料中决定硫酸铵的饱和度而添加方式和决定添加量的盐的速度适度，硫酸铵的饱和度高时引起盐析的蛋白质沉淀，如果离心盐析经常与等电点沉淀配合进行盐析，则在常温下盐析沉淀一般的方法是透析，即将蛋白质溶液放入秀析袋(通常是半透明纸纸)中，用缓冲液进行透析，不断地更换缓冲液，透析所需要的时间长，所以最好在低

14、温下进行。 另外，也可以用葡萄糖凝胶G-25和G-50的过滤柱除去盐，在比较短的时间内完成。(3)有机溶剂沉淀法，(冷乙醇、冷丙酮)原理：破坏蛋白质的水合层，降低溶液的介电常数在低温操作下添加0.05mol/L的中性盐可减少有机溶剂导致的蛋白质改性，提高蛋白质的分离效果，(1)由于有机溶剂容易使酶催化剂改性，所以酶催化剂沉淀分离后也立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂浓度，避免变性。 (2)用有机溶剂沉淀方法析出的酶催化剂沉淀比用盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，极限分辨率比盐析法好，也容易除去溶剂，但有机溶剂沉淀方法容易使酶催化剂变性，因此操作必须在低温条件下进行。 (3)添加0.05mol

15、/L中性盐可以减少有机溶剂引起的酶催化剂变性，提高酶催化剂的分离效果。 但是，中性盐会增加酶催化剂在有机溶剂中的溶解度，所以不要添加太多中性盐。 (4)有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法并用。 也就是说，操作时溶液的pH应该控制在要分离的酶催化剂的等电点附近。 (4)PEG沉淀法、PEG :聚乙烯管二醇是具有螺旋状和强亲水性的大分子物质， 生物化学分离中经常使用PEG2000-6000的基本原理：利用空间阻力效应lgsf=xa的蛋白质的大小：蛋白质的分子量越大，沉淀所需的PEG浓度越低的蛋白质的浓度：浓度高，容易沉淀，但分离效果差，所以为10mg/小于ml的PEG的聚合度： PEG的聚合度越高，

16、使蛋白质沉淀所需的浓度越低，但分离效果差，一般使用PEG的温度： PEG对酶催化剂(蛋白质)具有保护作用，因此可以在常温下操作，并且可以一次处理大量的样品一般在PH5-8的范围对离子力影响不大：离子力小于2则影响不大，(5)其他沉淀技术，重金属盐et al )生物碱试剂沉淀(丹宁酸、苦味酸、钼酸、三氯乙酸等)，8.5.2离心技术(Centrifugation )， 离心分离机的种类和用途离心分离方法的选择离心条件的确定注意事项、离心原理、根据将样品放入离心分离机进行旋转的粒子的不同，质量、密度、大小、形状等互不相同，因此即使在相同大小的离心场中，沉降速度也不同，从而得到相互的分离。离心力和相对离心力，溶液中的固相粒子进行圆周运动时产生向外的离心力，F=m2r式中，f是定义为离心力强度的m是沉降粒子的有效质量即离心转子的旋转角速度，其单位为r/min； r是离心半径(cm )，即从转子的中心轴到沉淀粒子的距离。 显然，离心力随着转速和粒子质量的增大而增大，随着离心半径的减小而减小。 当前离心力通常用相对离心力Fcf表示，即离心力f的大小是地球的引力(g )的几倍，单位是g，其修正公式是Fcf=1.11910-52