课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,尿素分子的立体结构,分解尿素的细菌:,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,2、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例： PCR技术,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求

2、，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多 数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,培养一定时间后，该目的菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,绝大多数微生物都能分解葡萄糖，但只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。请你分析该培养基是否具有选择作用？是何如选择的？,选择性培养基

3、 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,1.稀释涂布平板法。 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,.统计菌落数目：,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计

4、的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的的结果谁更接近真实值？这两位的实验需要改进吗？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,如何对细菌进行计数？,如何对细菌进行计数？,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,2、显微镜直接计数：,利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌； 不适

5、于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,相关计算,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原

6、因。,原因：(1)培养基污染，(2)混入了其他的含氮物质，(3)土样不同。,方案二：用完全培养基进行同样实验。,方案一：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果菌落数比A同学结果多，则证明A无误；如果结果相近，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,方案三：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,.设置对照：,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基接种

7、后培养观察菌落数目。,二.实验的具体操作 .土壤取样 土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中7090是细菌。在富含有机质的土壤层的3-8cm处中分布着绝大多数的细菌 取样要求：铲去表层土 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（三）样品的稀释,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得

8、到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的

9、重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,(六)计数,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,三.结果分析与评价 1.对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被污染；牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基具有选择性。 2.提示：如果得到了2个或2个以上菌落数在30300的平板，则说明操作成功可以计数。 3.土壤相同，数量应该一样，若不同则出现培养基被污染或者是操作不规范等原因。,四、操作提示,无菌操作,做好标记

10、,制定计划,1.进一步坚定尿素分解菌： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2.滤膜法： 测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,五.课外延伸,1.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,C,D,3.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结