RNA生物合成和加工.ppt

1、第36章 RNA生物合成和加工,内 容,第一节 DNA指导下RNA的合成 第二节 RNA转录后的加工 第三节 RNA指导下的RNA和DNA的合成,遗传信息传递的 中心法则,蛋白质,翻译,转录,逆转录,复制,复制,DNA,RNA,第一节 DNA指导下RNA的合成,转录（transcription）：生物体以DNA为模板合成RNA的过程，转录是通过DNA的指导下的RNA聚合酶的催化实现的。经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA 和 scRNA。 转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止,此转录区域为一个转录单位。 转录的起始是由DNA的启动子（prom

2、oter)控制的，控制中止的部位称中止子（terminator)。,1. DNA指导的RNA聚合酶,反应式： n1ATP RNA polymerase n2GTP n3CTP DNA, Mg2+(or Mn2 +) n4TTP,RNA,+(n1+n2+n3+n4)PPi,从聚合反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存在三个主要不同点： A转录中不需要RNA引物、以4种三磷酸核糖核苷（NTP）为 底物 ； B转录反应一般只用一小段DNA做模板； C在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。,启动子,终止子,模板链（负链，反意义链）,编码链（正链，有意义链）

3、,非信息区,DNA,5,5,3,3,两股DNA单链中只有一股可转录,可作为模板转录成RNA的一股称为模板链,对应的一股互补链称为编码链。能转录出mRNA然后指导蛋白质合成的部分称为结构基因。其余的DNA可能转录(rRNA,tRNA),也可能不转录。 不对称转录:DNA分子上一股可转录,另一股不转录;模板链并非永远在同一单链上。,大肠杆菌RNA聚合酶（456 kD),核心酶(2),起始因子, 酶的装配与启动子上游元件和活化因子结合 s 识别启动子，促进转录的起始 w -?,全酶(2 ),w,2 Zn,结合核苷酸底物 催化磷酸二酯键形成 和模板DNA结合,催化中心,转录泡，17bp,杂交体，8bp

4、,酶的移动方向,大肠杆菌RNA聚合酶进行的转录,RNA合成过程,起始 (pppG or pppA),双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),识别,NusA,大肠杆菌RNA聚合酶与DNA的相互作用,真核生物的RNA聚合酶 三种RNA聚合酶,它们专一地转录不同的基因,其转录过程和产物各不相同。三种RNA聚合酶对鹅膏覃碱的敏感性反应不同。,snRNA,U6, scRNA,r,5s-rRNA,2.启动子和转录因子,启动子( promoter)是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 R

5、NA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子(transcriptional factor)。 利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。,足迹法确定启动子序列,大肠杆菌启动子共有序列,A,G,T,C,TTGACA,AACTGT,Pribnow 框,-10,-35,识别区,16-19bp,5-9bp,起点,频度： T89 A95 T45 A60 A50 T95,有助于DNA局部双链解开,提供了RNA聚合 酶识别的信号,频度：T82 T84 G78 A65 C54 A45,真核启动子 分为类型I、II、III，分别由RNA pol I、II、III进行转录

6、。 类型I、III启动子种类有限，分别控制rRNA前体基因和小分子RNA的转录。,类型I(RNA聚合酶I)启动子,控制rRNA前体基因的转录，转录产物经加工后 生成各种成熟的rRNA。,类型I启动子由两部分保守序列组成： 核心启动子位于转录起始点附近（4520）。 上游控制元件（UCE）位于180107。 两部分都富含GC。,RNA聚合酶I的转录还需要两种辅助因子参与: UBF1: 可结合在两部分富含GC区 SL1：四聚体，含TBP和3个转录辅助因子TAFI, 结合在UBF1上, SL1 类似于细菌的s因子。,类型II启动子 类型II启动子涉及众多蛋白质基因的表达控制。包括4类控制元件： 基本

7、启动子 起始子 上游元件 应答元件 由相应的转录因子识别。 基本启动子序列中心在-25至-30左右，7bp保守区。称TATA框（TATA box）或Goldberg-Hogness框。 A63 A60 T82A97T93 A85A82 T37 T37,通用（基本）转录因子 通用转录因子（TFII）:指在启动子部位与RNA聚合酶II形成起始复合物（作用于基本启动子），启动转录的蛋白质因子，含量丰富，种类较少 。为所有类型II启动子起始转录所必需。,转录因子 亚基数 分子量 功能,TATA框是RNA Pol II和通用因子形成起始复合物的主要装配点。转录的起始位点处有一保守序列称起始子（initi

8、ator, Inr)， DNA在此解开并开始转录，其共有序列为：,RNA聚合酶II和转录因子在启动子上的装配,(TATA binding protein),CAAT框 中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT 功能：与RNA聚合酶结合 GC框 在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。 CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。,上游调控元件,类别III启动子（为RNA pol III所识别） 涉及小分子RNA，如：5S和tRNA，scRNA的转录。它位于转录起始点下游，也就是基因内部。,5SrRNA基因,boxA 中间元件 boxB,boxA b

9、oxB,腺病毒 VARNA基因,先由TFIIIA结合到boxA,然后促使TFIIIC结合，后者结合导致TFIIIB结合到转录起始点附近，并引导RNA pol III 结合在起点上。,+55 +80,3. 终止子和终止因子,提供转录停止信号的DNA序列称为终止子( terminator)。协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子 (termination factor)。有的终止信号的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这称为通读(readthrough)，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antitermination factor)。

10、,大肠杆菌两类终止子的回文结构,A. 不依赖于Rho（）的终止子,B. 依赖于Rho（）的终止子,富含G-C,系列U,4. RNA生物合成的抑制剂,核苷酸合成抑制剂,碱基和核苷酸类似物： 8-巯基嘌、呤8-氮鸟嘌呤、5-氟脲嘧啶（用于治疗癌、白血病等）,烷化剂：氮芥、磺酸酯、氮丙啶等 放线菌素：放线菌素D 嵌合剂：溴乙锭,与DNA模板结合的抑制剂 （抗癌、抗病毒药物）,RNA聚合酶的抑制剂,抗菌素:如利福平、曲张霉素 肽类化合物：-鹅膏蕈碱,第二节 RNA转录后的加工,细胞内由RNA聚合酶合成的原初转录产物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、 5 、3端的切除和特殊结构的形成、核苷酸的修饰

11、和糖苷键的变化、以及拼接和编辑等过程，才能转变成为成熟的RNA分子,这一过程总称之为RNA的成熟或转录后加工（post-transcriptional processing),细胞内的tRNA、rRNA相对稳定，半衰期一般为几个小时。所有的tRNA、rRNA都不是原初转录产物，都要经过一系列的加工才能成为有活性的分子。 原初转录产物的5是三磷酸（pppG、pppA）， 而成熟的tRNA、rRNA ，5是单磷酸。 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。 所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基（A、G、C、U以外的碱基）。,真核的mRNA多为单顺反子，含有多内含子。寿命比原核m

12、RNA的长。在原初转录物中，通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列。 原核mRNA为多顺反子，半衰期只有几分钟，一经转录即直接进行翻译，一般不需加工。但少数多顺反子mRNA需经过核酸内切酶作用，切成较小的单位后再进行转录，如：核糖体大亚基蛋白L10和L7/L12与RNA Pol b、b亚基基因组成的混合操纵子。,1. 原核生物RNA的加工 rRNA前体的加工 在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间（增加有效信息）。其它的tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子，它们在形式多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成

13、熟。,E.coli共有三种rRNA 5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA rRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30S。 E.coli有7个rRNA的转录单位（操纵子），它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。,甲基化作用 专一核酸内切酶,30S前体,P16,pre-tRNA,P23,专一核酸外切酶,16S rRNA,tRNA,23S rRNA,5S rRNA,专一核酸外切酶,大肠杆菌rRNA前体的加工,P5,RNaseE,16S rRNA,tRN

14、A,23S rRNA,5S rRNA,甲基化,E,III I,III,III,原核tRNA前体的加工 E.coli染色体基因组有60个tRNA基因，即某种a.a. 的tRNA基因不只一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在， 或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。 tRNA前体加工步骤： 核酸内切酶(RNaseP、RNaseF)在tRNA两端切断。 核酸外切酶(RNaseD)从3端逐个切去附加序列。 在tRNA3端加上-CCA-OH。 核苷的修饰（修饰酶):甲基化酶/S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。,tRNA前体分子的加工,a、切除tRNA前体两端多余的序列： 5端切除几到10个

15、核苷酸。,b、末端添加：3-端添加CCA序列。,c、修饰：形成稀有碱基如DH2 。,RNaseP,RNaseF,RNaseP,RNaseF,RNaseD,RNaseD,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,5,3,tRNA+CTP tRNA-C+PPi tRNA-C+CTP tRNA-CC+Ppi tRNA-CC+ATP tRNA-CCA+PPi,tRNA核苷酰转移酶,tRNA+SAM 甲基-tRNA+S-腺苷高半胱氨酸,tRNA甲基化酶,tRNA假尿苷合成酶催化尿苷的糖苷键发生位移 反应，由尿苷的N1变为C5。,2. 真核生物RNA的

16、加工,真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似，但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。 真核rRNA前体的加工 真核生物核糖体 小亚基含：16-18S rRNA 大亚基含：26-28S rRNA、5S rRNA、 5.8S rRNA（特有）。,真核rRNA基因拷贝数较多，几十至几千个之间，rRNA基因也成簇排列在一起。 18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。 5SrRNA基因也成簇排列，间隔区不被转录，由RNA聚合酶III转录后经适当加工。 哺乳动物：45SrRNA前体 含18S、5.8S、 28Sr

17、RNA 果蝇：38SrRNA前体 含18S、5.8S、28S rRNA 酵母：37SrRNA 前体，17S、5.8S、26S rRNA,rRNA在成熟过程中可被甲基化，位点主要在核糖2-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，约1-2%的核苷酸被甲基化。 真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。,真核tRNA前体的加工 真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。 真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA

18、基因由RNA聚合酶转录。 真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。,真核生物mRNA前体的加工 mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hn RNA）。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。 hnRNA半寿期很短，比细胞质中的mRNA更不稳定，一般在几分钟至1小时。而细胞质mRNA的半衰期为1-10小时，神经细胞mRNA最长可达数年。 hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括： 5末端形成帽子结构 3末端切断并加上polyA 剪接除去内含子对应的序列 甲基化,5 “帽子”,PolyA 3,顺反子(cistron ),

19、AAAAAAA-OH,mRNA的加工,加帽子,由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：CAP O型：m7Gppp CAP I型：N1核苷酸2-OH甲基化 CAP II型：N2核苷酸2-OH也被甲基化 5帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。 5帽子的功能 在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。 保护mRNA，避免5端受核酸外切酶的降解。,3端加polyA hnRNA链由RNase切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。 高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3端区都有一段非常保守的序列AAUAAA，这一

20、序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。 核内hnRNA的3端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA略长，平均150-200nt。,polyA的功能: 防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓 冲作用。 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。 mRNA甲基化 某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。,3. RNA的拼接、编辑和再编码,大多数的真核基因都是断裂基因，断裂基因的转录产物产物需要通过拼接，去除插入部分（即内含子，intron），使编码区（即外含子，Exon）成为连续序列，这是基因表达的一个

21、重要环节。RNA编码序列的改变称为编辑（ editing）， RNA编码和读码方式的改变称为再编码（recoding）。由于存在选择性的拼接、编辑和再编码，一个基因可以产生多种蛋白质。,鸡卵清蛋白成熟mRNA 与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,RNA的拼接和催化作用（内含子的切除） 多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区（外显子）成为连续序列。 有些内含子可以催化自身的拼接（self-splicing）,有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。,RNA的拼接有4种方式： 类型I自我拼接：如：四膜虫rRNA前体的拼接 类型II自我拼接：如：植物叶绿体基因的拼接 hn

22、RNA的拼接 核内tRNA前体的酶促拼接,RNA的拼接方式, 类型I自我拼接, 类型II自我拼接, 核mRNA的拼接体的拼接, 核内tRNA的酶促拼接,GT AG,U,类内含子的剪接机制,类内含子的剪接机制,hnRNA剪接反应是在剪接体（splicesome)上进行的 剪接体由5种U系列snRNA和50多蛋白质组成（U1、U2、U4、U5、U6） 与II型内含子剪接相似，只是由剪接体完成 真核生物所有编码蛋白质的核结构基因，其内含子的左端均为GT，右端均为AG。此规律称GT-AG规律，对于mRNA就是GU-AG 此规律不适合于线粒体、叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的核结构基因

23、,hnRNA的拼接,真核细胞内存在许多种类的小分子RNA，大小在100-300nt，有些由聚合酶III转录，有些由聚合酶II转录。 核内小RNA（snRNA）主要存在于核内，细胞质小RNA（scRNA）主要存在于细胞质。 重要的snRNA有U系列snRNA，因其尿嘧啶含量高而得名。U系列snRNA通常都与多肽或蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒（RNP）。 U-snRNA参与hnRNA的拼接过程。U3-snRNA与rRNA前体的加工有关，U1、U2、U4、U5、U6都与hnRNA的加工有关。,tRNA前体的拼接 酵母tRNA前体的拼接研究的最清楚。 酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1

24、/10，长度14-46bp，没有保守性。 切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是保守序列。 拼接过程： 第一步切除内含子 第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接,酵母tRNAPhe及其前体的结构,酵母和植物tRNA前体的拼接过程,反式拼接 内含子的拼接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式拼接（cis-splicing），但也有另一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反式拼接（trans-splicing）。 反式拼接的情况较为稀少，较典型的例子是锥虫表面糖蛋白基因VSG(variable surface glycoprotein)，线

25、虫的肌动蛋白基因（actin genes），和衣藻（Chlamydomonas）叶绿体DNA中含有的psa基因。,选择性拼接（alternative splicing ),一个基因的转录产物通过不同的拼接方式，得到不同的mRNA和翻译 产物，称为选择性拼接。所产生的多个蛋白质即为同原体（isoform).,（降钙素类）,（降钙素类相关蛋白）,（甲状腺）,RNA编辑的不同类型和分布,编辑类型 机制 存在,U的插入与删除 gRNA的转酯反应 锥虫线粒体mRNA C、A或U的插入 多头绒孢菌线粒体的 mRNA和tRNA G的插入 RNA聚合酶重复转录 副粘病毒的P基因 C转变为U 酶促脱氢 哺乳类肠

26、的Apo mRNA C转变为U或U转变为C 脱氢或氨基化 植物线粒体mRNA和tRNA 牛心线粒体tRNA A转变为I 脱氨 脑谷氨酸受体亚基mRNA,RNA的编辑,DNA的正链序列 GA G A A,mRNA的序列 GAU UGU AUA,蛋白质序列 Asp Csy Ile,锥虫线粒体 细胞色素氧 化酶亚基II,RNA的再编码 在正常情况下，mRNA的三联体密码子可以被的反密码子识别， mRNA携带的遗传信息得以正确表达，但是，基因的错义、无义和移码突变，改变了编码信息，使得蛋白质的活性降低或丧失。 校正tRNA通常是一些变异的tRNA，它们或是反密码子环碱基发生改变，或是决定特异性即个别碱

27、基发生变化，从而改变了译码规则，故而使错误的编码信息受到校正。 这是mRNA再编码的一种重要方式。,此外，核糖体在mRNA上移动时，在某些mRNA的一定位点上发生打嗝，由此改变阅读框，此过程称核糖体移码(ribosomal frame shifting),或叫程序性阅读框架移位（programmed reading frame shift),简称翻译移码（translational frameshifting).这一机制可以从一个mRNA产生两个或更多不同的蛋白质。,4. RNA生物功能的多样性,RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用。 RNA具有重要的催化功能和其它持家功能。 RNA转录后加工

28、和修饰依赖于各类小RNA和其它蛋 白质复合物。 RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用。 RNA在生物进化中起重要作用。,5.RNA的降解,RNA降解是涉及到基因表达的一个重要环节。 rRNA和tRNA是稳定的RNA ，其更新率低； mRNA是不稳定的RNA，其更新率非常高。因为mRNA与其编码基因的表达活性直接有关，不同的RNA需要以不同的速度进行降解。脊椎动物细胞mRNA的平均半衰期约为3 h, 细胞每一世代中各类mRNA约周转10次。细菌mRNA的半衰期大约只有1.5min，以适应快速生长和对环境作出快速反应的要求。 所有细胞中都存在各种核糖核酸酶，可以降解RNA。真核生物mRNA降

29、解的主要途径首先是poly(A)尾巴的缩短，去腺苷酸化能诱发脱去5端帽子结构，然后由53方向和35 方向降解mRNA。,第三节 RNA指导下的RNA和DNA的合成 以RNA为模板合成RNA ，是病毒RNA的特殊繁殖方式。有实验指出，当病毒RNA侵入寄主细胞后，这些病毒在RNA复制酶催化下即可自行复制产生新的病毒RNA。 RNA复制酶需要专一性的RNA模板，例如Q噬菌体的RNA复制酶只能用Q病毒RNA为模板，它不用寄主的RNA为模板。,一.RNA的复制,1. 噬菌体QRNA的复制 噬菌体Q：直径20nm的正十二面体，含30% RNA，其余为蛋白质，单链RNA，4500个核苷酸，编码3-4个蛋白质

30、。 结构：5端成熟蛋白（A或A2蛋白）外壳蛋白 （或A1蛋白）复制酶亚基3端 Q复制酶：四个亚基，只有是自己编码，其余三个亚基来自寄主细胞(:核糖体S1蛋白，：EF-Tu，：EF-Ts)。 进入E.coli细胞后，其RNA即为mRNA，可以直接合成与病毒繁殖有关的蛋白质（复制酶亚基）。 QRNA为正链RNA,A. 负链的合成,B. 正链的合成,病毒的正链,复制中间体,复制中间体,新合成的正链,新合成的负链,负链,噬菌体Q的合成,2. QRNA翻译和复制的自我调节 QRNA的高级结构（双螺旋区的结构）参与翻译的调节控制 （1）只有刚复制的QRNA，成熟蛋白基因才能翻译。 （2）核糖体能直接启动外

31、壳蛋白基因的翻译 （3）复制酶亚基基因只有在外壳蛋白合成时双链打开才能进行翻译。,QRNA的翻译、复制受寄主细胞调节，以正链RNA为模板复制负链RNA时，另需寄主细胞的HF和HF因子。而以负链RNA 为模板复制正链RNA时，不需这两个因子，感染后期大量合成的是正链RNA。,3. 病毒RNA复制的主要方式 正链RNA病毒（mRNA）：噬菌体Q、灰质炎病毒等 进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。 负链RNA病毒（带有复制酶）：狂犬病毒等 此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA（mRNA）

32、，再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。,双链RNA病毒（带有复制酶）：呼肠孤病毒等 以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA（mRNA），从而翻译出蛋白质，然后合成负链RNA，形成双链RNA，再包装。 反转录病毒（含反转录酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒 正链RNA病毒，它们的复制需要经过DNA前病毒阶段。,不同RNA病毒合成mRNA的途径,二.RNA的逆转录作用,概念:以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信 息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用（reverse transcription)。,逆转录酶（reverse transc

33、riptase)。,依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力,依赖RNA的DNA聚合酶活力,核糖核酸酶H活力,三种功能,逆转录过程,逆转录病毒的基因组,逆转录病毒基因组通常由两条+RNA链组成，因此是二倍体。5有“帽子”，3polyA,近5带有一个分子的tRNA,作为逆转录的引物。 携带3个基因： gag:基质蛋白、衣壳、 核衣壳蛋白 Pol：蛋白酶、整合酶、 逆转录酶 Env：表面蛋白、跨膜蛋白 Gag和pol通常翻译成一条多肽，之后由蛋白酶切成6个蛋白,逆逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,逆转录病毒 DNA的合成过程,U