蛋白质的测定

1、Determination of protein and amino acid in Food,第九章 蛋白质及氨基酸的测定,第一节 概述,1.蛋白质的元素组成（The elements of protein） C：50-55% N：15-18% O：20-23% H：6-8% S：0-4% 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。,4、蛋白质分析的重要性,生物活性测定 功能性质调查 营养标签 总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值,5、蛋白质的测定方法,利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法,凯氏定氮法 杜马斯法,福林酚法 染色法,第二节 蛋白

2、质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）,第三节 蛋白质的定量测定,关于氮-蛋白质换算等数,6.25,=,6.25,=,6.38,=,5.95,一、凯氏定氮法,常量凯氏定氮法 1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。,2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定, 消化,(

3、NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点,加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂,加氧化剂 加速有机物氧化速度, 蒸馏,NH4+ + OH-,= NH3 +H2O,影响氨化完全和速度的因素,（1）K氏烧瓶和取样量 （2）分解剂 1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml 还有一种比例：K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml,用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿） 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸）, 吸收与滴定,反应式为： NH3+H3BO3=NH4+H2BO3- H2B

4、O3-+H+=H3BO3, 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。,现测定某一种食品的蛋白质的含量， 这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理 后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分 结合，经振摇后大火加热进行消化；消化 2h后，估计消化完全，取出消化液加入少 量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲 基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对 吸收液进行滴定。,讨 论,大量的脂肪,振摇,大火加热,消化,2h后，估计消化完全,量NaOH,少,计 算,X =,X为样品中蛋白质的含量 V1为样品消耗盐酸标准液的体积 V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积 C为盐酸

5、标准液的浓度 MN为氮的摩尔质量 W为样品的质量 K为氮换算为蛋白质的系数,1.装水至 2/3 容积处，加甲基橙数滴及硫酸数毫升以保持酸性,7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏10min，将管尖端提离液面再蒸馏1min ，用水冲洗管尖后停止蒸馏,同时做空白,8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至 微红色为终点,2.管下端插入液面下(瓶内先装硼酸液及混合指示剂2滴),3.消化液 10mL,4.NaOH溶液,5.水洗漏斗数次,6.夹好漏斗夹，水封。,4.5.6步操作要迅速,微量凯氏定氮法,凯氏定氮仪,凯氏定氮仪,二、双缩脲法,150160,双缩脲,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶

6、液生成紫色络和物。,紫色络合物。,操作方法,1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：,取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2、样品测定 取4支试管分成两组，按下表平行操作：,取两组测定的平均值计算： Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） N为稀释倍数 c为样品原浓度（mg/ml）。,3、计算,福林-酚法（双缩脲法的发展）,两步反应,(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜络合物。,(2)此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸(olin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。,杜马斯法（燃烧法）,样品在高温下（

7、700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。,几种蛋白质测定方法比较,总氮量,蛋白氮,总氮量,蛋白氮,凯式定氮装置,分光光度计,高温装置、GC,分光光度计,浓硫酸,用量较少,不需要,福林-酚试剂,长,简单快速,3min,简单快速,其他方法,染色法,紫外 吸收法,水杨酸比色法,采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算： 水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度=0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的HCl溶

8、液的毫升数=22.5mL，空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。,第四节 氨基酸定量测定,一、甲醛滴定法,氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性-COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。,反应式（有几种不同的推论）如下：,双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂,同时取两份样, +中性红，用NaOH滴定, +百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴定,二、非水溶液滴定法,在水溶液中 1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质 2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄 3、本身会与水起反应而生

9、成酸的某些物质不能滴定。,溶剂选择原则,1、不引起副反应 2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物 3、应考虑溶剂的酸碱性 对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好,氨基酸的非水溶液滴定,1、选择冰乙酸作为溶剂,2、选择高氯酸进行滴定,三、电位滴定法,根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH 值判断和控制滴定的终点。,pH,8.2,9.2,氨基酸自动分析仪法,在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg于100mL 容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL进行测定，用 0.05N氢氧化钠滴定至pH值为8.2时，消耗标准碱液7.0mL, 加