微生物工程实验

1、发酵工程实验室规则,实验室内严禁饮食吸烟。 进入实验室需穿实验服。 实验前将桌面清理赶紧，非必要之用品放入抽屉中，必需用的书籍和文具等也应放置在非操作区，以免污染。 坐在实验椅上操作实验，勿随意走动或奔跑。 实验进行之前应确实了解其目的以及进行步骤，才能独立操作并于实验结束后分析结果。,认真进行各项实验，严格掌握无菌技术。各个实验用品按指定地点存放。 实验中发生差错或意外事故时，应立即报告老师及时处理。切勿隐瞒或自作主张不按规定处理，如万一发生有菌材料污染桌面、衣物等，应立即用抹布浸沾23%来苏（或5%石炭酸液），泡在污染部位，经半小时后方可抹去。如手上沾有活菌也用上述消毒液浸泡10分钟左右，

2、再以肥皂及自来水反复洗净。 要爱护室内仪器设备，按使用规则操作，并应节约使用实验材料。如不慎损坏了器材等，应报告教师。,做好实验记录，写好实验报告。 关于实验材料：培养基、培养液接种前均应清楚标示日期、组别、菌名及姓名。 实验结束后，使用过的仪器、设备、器皿一律物归原处，每组小组长负责清理工作。 值日生由各组同学轮流担任，负责实验结束后的整理、清洗及打扫工作，另外离开实验室后要负责水、电、门、窗的安全。 每次使用发酵罐及实验过程中换人时，必须填写好发酵罐使用记录本。实验过程当中，一台发酵罐必须要有至少一人看守。,考核方式 （1）实验报告：要求报告内容包括：题目、目的、原理、操作步骤、实验结果及

3、讨论。 （2）考核方式：平时成绩（实验预习、考勤、纪律、实验仪器的组装和使用能力，实验的技能技巧，实验态度以及安全、卫生和药品的节约等）占40%；实验报告占60%。,实验安排,液态发酵酵母菌的上罐发酵 菌种的扩培 发酵罐的结构和灭菌 单因素实验的设计与取样 单因素实验比较及生长曲线的测定 固态发酵葡萄酒的酿制及菌种的分离,实验一. 固体发酵葡萄酒的酿制及菌种的分离,实验目的 了解酵母菌作用下制成葡萄酒的过程。 熟悉葡萄酒的制作方法。 学习从发酵液中分离酵母菌。 实验原理 酵母菌在厌氧的状态下可把糖分解为酒精和二氧化碳。葡萄酒就是在酵母菌的作用下酿制而成。,实验药品及器材 葡萄；白砂糖；发酵器皿

4、；保鲜膜等 实验步骤 清洗：用水整串淋洗 ，用洗净的手将葡萄尽量撕揉碎，连皮、籽一起装罐。 。 入罐：粉碎后的葡萄果液可装入清洁最好消毒后的干燥陶瓷、玻璃、无毒塑料容器进行前发酵。（容器要稍大，以保证装葡萄果液后有30%的空间，因为剧烈发酵时会产生气泡，会将葡萄皮往上翻涌，装得太满会溢出容器 ） 加白糖量：每斤葡萄汁要加40-60克白糖（糖加少了，影响发酵和酒精度；加多了，成本高。而且糖浓度太大，会使单细胞酵母的细胞壁渗透压过大，影响生长） 。加糖一般分二次加入。第一次在装入葡萄后24小时，加入一半，3-4天后视发酵情况再加剩余的一半。,前发酵：装瓶罐后，先在25-28度环境里放置24小时，不

5、要加糖。前发酵时容器不能密封，酵母繁殖需要氧气，发酵过程中会产生的二氧化碳需要排除，还要将上浮的果皮按入果液中进行搅拌，又要分次加糖搅拌等一系列的操作，都需要开盖才行。经过一周左右发酵，把糖消耗完毕后自然停止发酵，果皮不再浮上来，即达到止发酵点。6-7天后应把皮、籽过滤取出。 后发酵：一般前发酵7天后，将果汁内的皮、籽用筛网或尼龙纱网布过滤取出，用滤纸再过滤一次 ，装入清洁容器密封进行后发酵20-30天。此时容器最好不留空隙，切断氧气，防止细菌侵入。也可在液面上加些食用酒精，酒精比重比葡萄酒小，浮在表面形成保护层隔断氧气。同时要避光，防止酒色氧化变浅，所以，容器不能用透明的瓶。后发酵时用软木塞

6、密封装瓶,30天后启封，可以发现酒液变澄清，底部有一层沉淀，这是酵母完成历史使命后的“尸体”及杂质。 上层的清纯酒液同样用虹吸或过滤的方法再提纯一次。用不透光的酒瓶灌装，然后密封，存放温度最好在12度，酒瓶横躺或略微瓶口向下倾斜存放，可保存二年左右。 酒精度的测定：对第7天，第30天的葡萄酒液测酒精度 用4层纱布过滤发酵液. 量取过滤液100ml于蒸馏瓶中，另加入50ml蒸馏水，加入数粒玻璃珠防止暴沸，装上冷凝管，加热蒸馏，直至馏出液体积约为95ml时，停止蒸馏。 用蒸馏水定容至100ml，用酒精计测量，按测得的实际温度和酒精计示值查附表2，换算成20时的酒精度。 实验结果及讨论 从色、香、味

7、以及所测得的酒精度等方面对所酿制的葡萄酒进行评价 从葡萄酒中分离野生型酵母菌,取成熟前15天的紫皮中等颗粒的葡萄750克，挑出烂葡萄； 摘除蒂，用洗净的手充分捏碎葡萄； 装入清洁的非金属容器加盖，在20-25度环境中放置24小时； 加入30-40克白糖，用木筷拌匀，并把葡萄皮按入果液中； 发酵3-4天后再加入30-40克白糖拌匀，并把浮起的葡萄皮按入果液中； 7天后发酵停止，用非金属筛网布和滤纸、细布过滤去掉葡萄皮及籽； 静止12小时，用乳胶管虹吸出清纯酒液（或用滤纸、细布过滤）后装瓶密封； 30天后，再过滤一次装瓶密封、避光、低温、平躺保存。,酒精度的测定：对第7天，第30天的葡萄酒液测酒精

8、度 用4层纱布过滤发酵液. 量取过滤液100ml于蒸馏瓶中，另加入50ml蒸馏水，加入数粒玻璃珠防止暴沸，装上冷凝管，加热蒸馏，直至馏出液体积约为95ml时，停止蒸馏。 用蒸馏水定容至100ml，用酒精计测量，按测得的实际温度和酒精计示值查附表2，换算成20时的酒精度。 查阅相关资料，设计实验从葡萄酒中分离野生型酵母菌 实验结果及讨论 从色、香、味以及所测得的酒精度等方面对所酿制的葡萄酒进行评价 对分离所得的野生型酵母进行描述,实验二、菌种的扩培,实验目的： 熟练掌握无菌操作技术 了解生物发酵过程中种子的扩培过程 实验原理：,扩培过程,实验器材 实验仪器 摇床 1台；超净工作台 6台；电炉 6

9、个；玻璃棒 12个；50ml量筒 6个；500ml量筒 6个；100ml烧杯 6个；500ml烧杯 6个；250ml三角烧瓶 12个；500ml三角烧瓶 30个；接种环 6个；酒精灯 6个；棉线、纱布、报纸若干；天平 6个 药品 蛋白胨、葡萄糖NH4Cl、蒸馏水 菌种 酵母菌斜面 6支 种子培养基及发酵培养基 蛋白胨 10g 葡萄糖40g，蒸馏水1000ml，pH自然，115，20min,实验步骤 斜面的活化： PDA培养基100ml，分装试管，灭菌后摆成斜面。 接酵母于斜面中，28，48h 种子的培养 种子培养液的配置500ml，取部分种子液于2个250ml锥形瓶，每个锥形瓶装50ml（作一

10、级种子瓶），余下种子液分装于四个500ml锥形瓶中，每个锥形瓶装100ml（作二级种子瓶），115，20min灭菌。 用接种环挑取斜面2环转接于一级种子液中，150rpm，28，48h。 取一级种子液，无菌操作将种子液混合均匀以后，用移液枪以10%的接种量接种于二级种子液中，150rpm，28，48h。 准备一瓶无菌蒸馏水 500ml，灭菌，待用。,实验步骤 通过按照给定的研究题目，独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。 各组独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过

11、程,实验三、发酵罐的结构与灭菌 实验四、单因素实验的设计与取样,实验目的： 掌握小型发酵罐管路消毒、空消、实消、菌种培养等技术。 学习掌握小型发酵罐接种、取样操作系统 。 实验原理： 发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动的调控实验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等学科研究所必需的设备。,小型发酵罐：它主要有6部分组成。 罐体、搅拌系统、传热装置、 通气系统、消泡系统和各种参数检测器 离位发酵罐和在位发酵罐,实验器材 高压蒸汽灭菌锅3台；在位机械搅拌式发酵罐3台；离位机械搅拌式发酵罐3台 菌种：E.coli 种子液；无菌蒸馏水；泡敌 铁架台6个；试

12、管架6个；三角烧瓶；小试管；酒精棉球若干；工业用酒精一瓶 棉线手套 6双；接种用的大试管 60支；,实验步骤 在位发酵罐灭菌 空气过滤器及管路的消毒：蒸汽经空气过滤器及以后的空气管道进入发酵罐内。压力保持在0.100.11MPa之间。（注：压力不得超过0.12MPa，否则过滤器芯会损坏） 。消毒时间为30min。到时间后，关闭蒸汽阀。将空气经流量计进入空气过滤器（0.4VVM），吹干20min。 空消 ：排尽蒸汽管中的冷凝水，使蒸汽从罐底缓慢进入发酵罐（微开）。打开上部蒸汽阀，使蒸汽通过进气管进入发酵罐；对发酵罐进行空消。在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.110.12MPa之内，空消时

13、间为3050min。当温度降至80以下时，才能排尽发酵罐内的冷凝水，随即关闭冷凝水阀。调节进气管和排气口，使罐压保持在0.030.05MPa之间。,加培养基液 ：打开发酵罐的排气阀，调小进气阀得开度，卸去罐内压力；按要求各组配制不同的发酵培养基2.5L ，加入培养基。加消泡剂1.5ml（0.030.035%）。拧紧加料口螺母。 实消（必须将安全防护罩装上） 排尽加热管的冷凝水，通入蒸汽，加热培养基，同时开通电源，开启搅拌电机，调节电机转速至150rpm左右，进行慢速搅拌。 当发酵罐内温度达到85后，打开蒸汽阀门，将蒸汽徐徐进入发酵罐，继续升温。 当温度达到95100后，停止搅拌，并将排气阀微开

14、。调节底部及上部的蒸汽阀及排气阀，使压力保持在0.10.11MPa之间，严禁超压。（罐压不得超过0.12MPa，防止引起设备的损坏）。实消时间一般为20min。到时间后，关闭所有的阀门,自然冷却10min左右。,关闭加热管蒸汽阀，通冷却水打开电磁阀，按冷却键至“自动”状态。当温度降至发酵0后，慢速（150rpm）开启搅拌机，加速降温。 当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开气进气阀，让空气进入发酵罐内，并保持压力在0.030.05MPa之间，温度控制在28 。 取样方法：打开排气阀，用蒸汽消毒2030min。关闭蒸汽阀，放出少量料液。关

15、闭阀门，再用蒸汽消毒。,离位发酵罐的灭菌 实消 关闭电源开关，旋下电机接头、温度传感器接头、泡沫传感器接头、加热器接头、pH接头、DO接头；向上取出电机，并妥善放置；取出温度传感器、加热器、pH电极、DO电极。 将2.5L培养液从接种口倒入发酵罐内，盖上接种口螺帽。 将所有阀门拧紧，补料口用硅胶管两两连上，保持密封。 进气口与空气过滤器之间用胶管夹夹住，以防在实消时发酵液倒流至空气过滤器中，造成过滤器失效。取样口、进气口及空气通道必须用夹子加紧。 将发酵罐（连支架）平稳的端起，并放入立式灭菌锅内。开启灭菌锅进行灭菌，115，灭菌25分钟。,注：灭菌时间到后，不要手动排高压蒸汽锅内的蒸汽，必须是

16、高压灭菌锅内的压力慢慢降下来。如果手动排高压灭菌锅内的正气，则发酵罐内的物料会因快速沸腾，造成料液溢出发酵罐；而且，还可能引发酵罐内的压力比高压灭菌锅内的压力高很多，造成发酵罐的破裂。,冷却： 实消结束后，待发酵罐在灭菌锅内自然冷却20min且温度小于80后取出。 将电极按原位安装于发酵罐顶部，并联接妥电机线。 通入空气；正确连接冷却水进、出管道。 打开电源开关，调整转速、温度设定值（建议：转速：150rpm；温度：培养温度）,取样方法： 打开取样口的胶管夹即可取出样液。 取样后，打开取样管空气，将取出管中残留的发酵液吹出，用胶管夹将取样口封闭；然后封闭进入取样管的空气管。,注意：必须轻拿轻放，以免引起玻璃筒损伤和损坏。,接种、取样 在接种口周围围上酒精棉球，点燃，无菌操作接入种子液。 控制罐压在0.030.05MPa，温度为28，转速为150rpm。 取样时间各组可根据自己的时间进行取样，培养48h，取样6次。 出料 发酵罐的清洗,实验五、单因素实验比较及生长曲线的测定,实验目的： 了解碳源、氮源的变化对微生物生长的影响 掌握两种生长曲线的测定方法：干重法和血球计数板法 实验原理（略）,实验药品及器材 离心机2台；振荡器6