副溶血性弧菌标准的检验方法

1、副溶血性弧菌是一种广泛分布于海水、海底沉积物、浮游生物、鱼类和贝类中的海洋细菌，是由海产品引起的急性胃肠炎的重要致病菌之一，尤其是在夏季和秋季的沿海地区，常因食用含有大量副溶血性弧菌的海产品而导致爆炸性食物中毒。在非沿海地区，因食用被这种细菌污染的食物而中毒的人也时有发生。为确保食品卫生和食品安全，根据副溶血性弧菌的特点，进行了以下鉴别诊断试验。第1节副溶血弧菌的标准试验方法一、检验方法(一)操作步骤1.分离培养：首先称取25克样品，加入225毫升3.5%灭菌盐水，用匀浆器打碎或研碎，分别接种一个氯化钠琼脂平板和一个嗜盐琼脂平板，同时向100毫升增菌液中加入10毫升，在37放置8 16小时，然

2、后放在上述平板上分离，取出在37观察18 24小时，挑出可疑菌落2.涂片镜检：对三糖铁培养基上的可疑反应进行革兰氏染色镜检，即底层变黄(葡萄糖产生酸，但不产生气体)，上斜面保持不变(乳糖和蔗糖不分解)，是动态的，不产生硫化氢。3.耐盐试验：将上述可疑培养物接种不同浓度的盐蛋白胨水(0%、3%、7%、10%)，在37培养24小时。对于那些不在无盐和10%无盐蛋白胨水中生长并且在3%和7%含盐蛋白胨水中生长良好的人，继续进行以下相关试验。4.生化试验：接种下列生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛蓝基质、钒磷、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢和溶血试验，37培养。除了培养48小时并加入试

3、剂的钒磷、靛蓝基质和甲基红，结果在24小时内观察到。5.动物实验：将符合各种反应的副溶血弧菌接种3.5%氯化钠蛋白胨水，在37培养16 18小时，然后腹腔注射0.3毫升，观察2 3天。解剖并分离死老鼠进行培养。(2)检查程序图6-1副溶血弧菌检验程序二、结果分析判断及注意事项(a)样本处理取样时，应首先注意准备消毒器具和容器。代表性样品应通过无菌程序采集。样品应尽快送去检验，不应存放太久。副溶血性弧菌在合适的温度下繁殖迅速，但不适合在低温下存活。在寒冷的条件下很容易死亡，以防止被检查的材料冻结，以免影响检查结果。有时，由于储存条件的影响(如低温冷冻或干燥时间过长)，细菌会受到伤害，因此有必要对

4、这类可疑食品或可疑有毒物质进行富集培养。但是，应该注意的是，为了便于细菌的回收，不建议选择具有强抑制作用的培养基，否则会影响细菌的生长。富集8 16小时后，将样品转移到平板上进行分离，选择可疑菌落接种在含3.5%盐的三糖铁培养基中。此时，所选菌落的数量不应少于5个，尤其是在夏季，当海鲜混合时，相互污染严重，并且有时存在大量不同类型的细菌以防止泄漏检测。(2)形态和染色革兰氏阴性非芽孢杆菌，易呈多种形式，如棒状、弧形、椭圆形、球形、丝状等。排列不规则，多为散生，偶有成双排列，一般大小为0.3 0.7 um 1 2 um，一端有鞭毛，动态，活跃，两端密集染色，在固体培养条件下可生长外围鞭毛。(三)

5、文化的特征它可以在普通琼脂培养基和普通液体培养基中生长，但不能在无盐条件下生长。它在含2% 3%氯化钠的培养基中生长最旺盛，当氯化钠溶液浓度达到10%以上时不繁殖。在肉汤、蛋白胨水和其他液体培养基中混浊生长，具有很强的有氧能力，经常在液体表面形成细菌膜。在液体培养条件下，细菌大多生长成单鞭毛，并主动运行。在固体培养基上，菌落通常是凸起的，圆形，稍混浊和不透明，表面光滑湿润，无色素。在新鲜的潮湿或软琼脂培养基上，一些副溶血弧菌可以形成不规则的菌落或呈片状扩散，并可以在含0.7%以上琼脂的培养基上生长外周鞭毛(侧毛)。一般来说，2025培养的鞭毛相对稳定，而37或24小时以上培养的鞭毛容易自然脱落

6、。有鞭毛的菌株大多在固体培养基上呈扩散生长，而有单鞭毛的菌株是固体培养基上的典型菌落，但不呈扩散生长。培养基的不同条件，如成分、类型、温度、湿度等。会影响扩散生长，而菌落形态也很容易受条件的影响而改变。例如，它通常在嗜盐菌平板上生长良好，而在SS琼脂平板上它主要是一个小的扁平菌落，很难被搅动。当溶血环在血液修复中快速生长时会出现，它们是BCBS(硫代硫酸盐、柠檬酸盐、胆盐、蔗糖)和氯化钠蔗糖琼脂平板上的浅蓝色或蓝绿色菌落。一般来说，从腹泻患者中分离出的大多数细菌在初始阶段都是典型的菌落。当细菌长时间储存或条件不合适时，菌落通常变得粗糙，形状不规则或菌落解离，其中一些沉淀并在液体培养物中生长。生

7、长范围为510，最适pH为7.28.2，最适发育温度为3037。(4)生化特性该细菌可以从葡萄糖中产生酸，而不产生气体、乳糖和蔗糖、甘露醇、靛蓝基质和硫化氢。甲基红为阳性，V-P为阴性，赖氨酸为阳性，精氨酸为阴性，鸟氨酸为阳性，少数为阴性，溶血为阳性，少数为非溶血性。主要生化特性见表6-1。近年来，随着细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，一些海水嗜盐弧菌已逐渐被人们所认识，其主要生化特性与副溶血弧菌的比较见表6-2。表6-1副溶血弧菌的主要生化特性项目项目耐盐性0%-甲基红+7%+v .p-10%-靛蓝基质+葡萄糖产生酸+赖氨酸+葡萄糖产生气体-鸟氨酸+/-蔗糖-精氨酸-甘露醇+溶血的+/-

8、硫化氢-注：积极；-否定的；大多数是积极的，少数是消极的。表6-2副溶血弧菌与其他弧菌的鉴别细菌名称氧合酶葡萄糖产气赖氨酸酸精制氨酸鸟氨酸靛蓝碱树胶液化v！p乳糖甘蔗糖乙二醇肌肉酒精阿拉博糖甘露糖鼠李糖-半乳糖苷硝酸盐游泳盐蛋白胨水，%06810副溶血性弧菌+-+-+-+-d+-+d-+-溶藻弧菌v .溶藻弧菌+-+-+-+-+-+-+dO1霍乱弧菌v .霍乱弧菌o1 EO 1+-+-+d(d)+-+-+-d-非o1霍乱弧菌+-+-+d(d)+-d-+d+d-最小弧菌v .最小弧菌+-+-+-(d)-+-+-+-+d-弧菌弧菌+d-+-d+-+-+dd+-+d创伤弧菌v .创伤弧菌+-+-+-

9、+dd-+-+-d-弧菌v.metschnikouii v .-d+-d+d+d-d-d-d-霍利斯弧菌v.hollisae+-+-+-+-d-v.damsela-d+-+-+-+-d-注：90%为阳性；-90%以上为阴性；()慢阳性；D 11% 89%为阳性；(d)11 89%为延迟阳性。(5)溶血试验我妻子的溶血反应是在有限的条件下，在高盐血琼脂培养基中培养副溶血弧菌时发生的，这被称为“神奈川现象”。本试验的要求是从人或兔的新鲜红细胞制备高盐血平板，在37培养24h后，如果单个菌落周围有透明的溶血环或菌落下有明显的溶血，则为神奈川现象阳性，如果没有透明的溶血环或明显的溶血，则为神奈川现象阴

10、性。大多数致病性副溶血弧菌为神奈川阳性，但少数为阴性。(6)动物试验用小鼠测定上述可疑菌株的毒力，将培养16 18小时的蛋白胨水或肉汤注入小鼠腹腔0.3 0.5毫升，有毒力的可在5 10小时内死亡，老年人约在24小时内死亡。在发病时，会出现毛发直立、活动不活跃、腹部靠近池底、呼吸困难、四肢痉挛、尾巴痉挛和震颤等症状。在解剖死小鼠后，取出内脏器官如心脏血液进行分离，并且可以检测测试细菌的纯培养物。对照组动物观察2 3天，未见异常现象。然而，应该注意的是，一些溶藻弧菌也能导致小鼠死亡，这有时很难区分。在进行上述试验后，有必要对毒力进行确认，并对结果进行综合判断。第三，培养基(1)氯化钠结晶紫富集液

11、成分：蛋白胨20g氯化钠40g0.01%结晶紫溶液5mL蒸馏水1000毫升pH9.0制备方法：除结晶紫外，按上述成分制备，加热溶解，加入约4.5毫升3%氢氧化钾溶液，调节酸碱度，加热煮沸，过滤，然后加入结晶紫溶液，混合装试管，121高压灭菌15分钟。(2)氯化钠蔗糖琼脂成分：蛋白胨10g浓缩牛肉汁10g氯化钠50克蔗糖10g琼脂18g0.2%溴百里酚蓝溶液20毫升蒸馏水1000毫升pH7.8制备方法：将牛肉膏、蛋白胨和氯化钠溶于蒸馏水中，调节酸碱度，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装100毫升烧瓶，在121高压灭菌15分钟。使用前，在100毫升培养基中加入1克蔗糖，加热融化，冷却至50

12、，倒入盘中。(3)嗜盐菌的选择性培养基成分：蛋白胨20g氯化钠40g琼脂17g0.01%结晶紫溶液5mL蒸馏水1000毫升pH8.7制备方法：除结晶紫和琼脂外，其余成分按上述组成配制，调节酸碱度，加入琼脂，加热溶解，加入结晶紫溶液，烧瓶内装100毫升。(4) 3.5%氯化钠三糖铁琼脂成分：蛋白胨20g浓缩牛肉汁5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖第一代氯化钠35g硫酸亚铁铵0.2g硫代硫酸钠0.2g琼脂12g酚红0.025克蒸馏水1000毫升pH7.4制备方法：将除琼脂和酚红外的所有成分溶于蒸馏水中，调节酸碱度，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶解，加入0.2%酚红溶液12.5毫升，摇匀，装试管，121高压

13、灭菌15分钟，置于高坡上备用。(5)氯化钠血琼脂(我妻子的培养基)成分：酵母提取物3g蛋白胨10g氯化钠70g磷酸氢二钠5g甘露醇10g结晶紫0.001g琼脂15g蒸馏水1000毫升制备方法：调节酸碱度至pH8.0，加热30分钟(无高压)，冷却至45左右，加入新鲜人血或兔血(5% 10%)，混匀，倒入盘中。(6)嗜盐菌测试培养基成分：蛋白胨2g氯化钠加入不同的量蒸馏水100毫升pH7.7(7) 3.5%氯化钠生化试验培养基配料：牛肉酱5g蛋白胨10g氯化钠35g磷酸氢二钠2g0.2%溴百里酚蓝溶液12mL蒸馏水1000毫升pH7.7制备方法：将上述成分分配后，根据所需的糖发酵管加入各种糖，葡萄

14、糖发酵管可按0.5%的葡萄糖加入，然后用小倒置管包装在试管中，在121高压灭菌15分钟。其它培养基可装入100毫升瓶中，在121高压灭菌15分钟，分别用10%溶液配制。同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100毫升培养基中，无菌分装于小试管中。(8)葡萄糖和盐蛋白胨水(用于磁共振血管造影试验)Ingredien磷酸氢钾5g氯化钠30克制备方法：加入1000毫升蒸馏水，摇匀后加热至完全溶解，冷却后装入小试管，在121高压灭菌15分钟。(9)盐蛋白胨水(用于靛蓝底物试验)成分：蛋白胨20g氯化钠30克蒸馏水1000毫升pH7.4制造方法：根据上述分配系统，包装小试管，在121高压灭菌15分钟。(10)运动测试介质配料：牛肉酱3g蛋白胨10g氯化钠30克琼脂4g