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文档简介
1、三、基因操作的基本步骤,1,从细胞中分离出DNA,从大肠杆菌中提取质粒,提取目的基因,目的基因与运载体结合,DNA连 接酶,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与表达,三、基因工程操作的基本步骤,2,3,基因操作“四部曲”即四个基本步骤:,1)提取目的基因,2)目的基因于运载体结合,3)将目的基因导入受体细胞,4)目的基因的检测和表达,4,步骤一:提取目的基因,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,5,目的基因的提取方法,直接分离基
2、因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,:鸟枪法,6,1 . 鸟枪法(散弹射击法) 用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(即扩增),从中找出含有目的基因的细胞,再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。,7,(2)基因文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,方法一:直接分离法(鸟枪法),8,1)反转录法: 以目的基因转录成的信使RNA为模
3、板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,9,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,根据已知蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,10,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?,操作简便广泛使用,工作量大,盲目,分离出来的有时并非一个基因
4、,专一性强,操作过程麻烦,mRNA很不稳定,要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,11,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术?,1)DNA序列自动测序仪: 2)PCR技术:,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,12,13,步骤二:目的基因与运载体结合,1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一个切口,露出黏性末端。 2)用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端。 3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了一个重组DNA分子(重组质粒),目的基因与运载体的结合过程,实际上是不同来源的基
5、因重组的过程。,14,15,常用的受体细胞:,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三:将目的基因导入受体细胞,16,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 (1)电击法:借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 (2)显微注射法:利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 (3)直接吸收法:把目的基因和宿主细胞混在一起,让其吸收。 (4)基因枪法:在金属微粒上涂一层目的基因,然后发射到宿主细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 (1)质粒是细菌染色体DNA以外的环
6、状双链DNA分子,它能自我复制,也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因,这可以从细胞的表型特征来识别。 (2)噬菌体是一种细菌病毒,其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。 (3)科斯质粒是一种杂种质粒,含有质粒和噬菌体的部分顺序,很适合用作真核生物基因的载体。,17,1.将目的基因导入植物细胞,18,2.将目的基因导入动物细胞,19,1)将细菌用CaCl2处理,以增大细菌细胞壁的通透性。 2)使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3)目的基因在受体细胞内,随其繁殖而复制,由于细菌繁殖的速度非常快,在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,例如:将目的基因导入微生物细
7、胞,20,步骤四:目的基因的检测和表达,检测是否导入:,看标记基因控制的性状是否表现,21,不能,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗?,若不能表达,要对抗虫基因再进行修饰。,检测是否表达:,看目的基因控制的性状是否表现,22,多细胞生物的检测,将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体,检测这些个体是否摄入目的基因,摄入的基因是否表达(是否表现出相应的性状)。淘汰无变化的个体,保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例:用棉铃饲喂棉铃虫,如虫吃后不出现中毒症状,说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡,
8、则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,23,24,1)以下说法正确的是 ( ) A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,25,2)不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 ( ) B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,26,3)有关基因工程的叙述中,错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,27,4)有关基因工程的叙述正确的是 ( ) A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的
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