基因转染技术及其应用简介.ppt

1、a，1，基因转染技术及其应用概述，报告人：陈红平2006年11月，安德鲁法尔和克雷格罗，a，2，报告内容，1，基因转染概述2，基因转染技术应用，a，3，1 . 2、转基因技术广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。 一、基因转染概要、a、4、二、基因转染的基本方法、(一)重组子(二)构建基因转染真核细胞的基本方法、a、5、(一)重组子的构建， 一、目的基因的制备和获得二.哺乳动物细胞表达载体的选择三. dna片段的重组连接四. dna重组体的鉴定，a，6，(一)目的基因是研究或应用的基因，即克隆或表达的基因或基因片段(2)目的基因的一般制备方法a .限制酶切除a .来自原核基因组DNA的原始基

2、因组物理图谱的已知或未知、克隆方法不同。 b .从真核基因组DNA中c .从克隆的DNA片段中a， 8 b .基于PCR或RT/PCR法的目的基因a .取得已知的基因数据的基因序列(或基因的两侧序列已知)设计/合成一对引物 PCR (基因组DNA为模板)/RT-PCR(mRNA为模板)组织或细胞吗PCR文库法基于未知基因的mRNA末端，例如polyA尾设计共同引物用工具酶将使用的mRNA和逆转录cDNA添加到cDNA末端用一对共同引物扩增所有的cDNA， 构成插入适当载体的PCR-cDNA文库的筛选，a，9，c .计算机克隆即利用GenBank信息，利用不同种类的同源性设计引物，获得未知基因片

3、段的尝试有多种计算机软件d .化学合成法制备基因片段使用DNA合成器，逐步合成、连接目标基因，可以得到目标基因。 a，10，2 .哺乳动物细胞表达载体的选择，哺乳动物细胞表达载体有两种：质粒型载体和病毒型载体a .典型的哺乳动物细胞表达载体为以下顺式作用元件： a .启动子b .增强子c .聚腺苷化信号d .药物选择标记e .报告基因f .表位标签，a，11， b .常用的哺乳动物表达质粒载体a.PC DNA3. lb.psic.pcmv-had.Pb UDC4.1e.ptre，a，12，(2)病毒型载体病毒型载体将外来基因导入哺乳动物细胞，或哺乳动物细胞的缺陷基因目前应用的病毒类型有逆转录病

4、毒、腺病毒、天花病毒和棒状病毒等。 a .逆转录病毒载体逆转录病毒的优点是能够将外来基因整合到基因组中，从而实现稳定的传代和表达。 但是，由于逆转录病毒的插入部位是随机的，所以基因组内的整合可能破坏内源性基因的结构，特别是插入重要的基因部位就会引起细胞异常。 a、13、b .腺病毒载体容易培养、纯化，在感染过程中可以复制和转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可以插入大的外来基因片段，腺病毒基因不整合，是研究真核基因的好模型。a，14，3.DNA片段的重组连接，a，15，4.DNA重组体的鉴定，外来DNA片段是否插入载体中构成重组DNA分子，插入片段的大小、变异和插入位置，顺序和方向是否表达载体构建所需

5、的基因和表达，相应的产品需要进一步鉴定DNA重组体(1)的酶切鉴定的下述： A .基于限制性图像的个体特异性，不同的载体和DNA分子的物理图像不同，酶切后的片段大小不同，电泳图像不同。b .同一载体连接不同的DNA片段，不同的载体连接同一片段(片段也有部位)的酶切图像不同。 c .插入法(单酶单点)或替代法(双酶双点)的酶切，一般使用3种限制酶切，载体和插入片段的大小、方向、切断后进行电泳分析，判断是否得到了期望的rDNA。 构建a，16，(2)DNA重组体，只要是为了克隆某个基因，就可以用序列进行测定。 (3)构建表达载体可以进行表达产物的鉴定。 a、17、外源基因转染方法要求转染效率高，不

6、影响细胞正常生理活动，低毒性，易用，重现性好，容易得到稳定的转化子。 根据转染机制转染法为：1.化学转染法2 .物理转染法3 .病毒感染法，(2)基因转染真核细胞的基本方法，a，18，1 .化学转染法，化学现在使用最广泛的是人工体质法。 1.DEAE-葡聚糖是最初应用哺乳动物细胞感染的试剂之一。 DEAE-葡聚糖是阳离子性的多聚物，与带负电的核酸结合，靠近细胞膜摄取。 DEAE一葡聚糖的转染很快就开始了，但不可靠。 a、19、2 .磷酸钙共沉淀转染法因为试剂容易获得，价格便宜，广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究。 方法：首先将DNA和氯化钙混合，加入PBS中逐渐形成DNA磷酸钙沉淀，加入培养了含

7、有沉淀悬浊液的细胞，在细胞膜的内皮素作用下摄取DNA。 3 .人工脂质体法脂质体也能介导DNA和RNA动物和人体内，用于基因治疗。 人工合成的阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合形成化合物，复合物靠近细胞膜时被内部吞噬，进入细胞质，然后DNA复合物释放到细胞核中。 包括a、20、2 .物理方法、穿孔、显微注射和基因枪等方法。 (1)穿孔法利用高电压脉冲对细胞膜的干扰，形成有利于核酸侵入的细孔。 穿孔技术可以应用于瞬间转染和稳定转染，便于浮游细胞，重现性好，但需要很多细胞。 影响感染效率的因素是脉冲强度和持续时间。 必须找到不杀细胞就能有效放出核酸的最佳平衡。 虽然a、21、(2)显微注射法很费工夫

8、，但是作为将核酸导入人细胞和核的方法非常有效。 此方法虽然经常制造转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。 (3)基因枪法是依靠负载了核酸的高速粒子将核酸诱导到人细胞内的方法，适用于培养的细胞和体外细胞。 a、22、3 .病毒感染法、病毒粒子是非常有效的基因释放系统，是将外来基因诱导到大量细胞中的最有效方法。 病毒感染具有高效、可稳定遗传、各种来源的细胞和操作简单等优点。 但是，很多病毒有潜在的危险性，操作者需要一定的病毒操作经验和良好的设施。(1)逆转录病毒(2)腺病毒，a，23，3，转基因技术的应用，(1)转基因植物，(2)转基因动物，(3)生物制药，(4)基因治疗(RNAi技术，a

9、，24，(1)转基因植物，1 .转基因植物1 .转基因植物的发展简史；(1)1983年世界上第一种转基因植物烟问世；(2)19962005年，世界上转基因植物在21个国家栽培，面积从1996年的170万公顷增加到2005年的9万公顷世界上转基因作物仅种子的销售量就达到了2005年的52.5亿美元，是1995年的63倍，a、26、2 .转基因植物类型(1)抗除草剂基因(2)抗虫基因(3)抗病基因(5)抗逆境基因，a 27、(2)转基因动物，1 .转基因小鼠2 .转基因牛3 .转基因猪4 .转基因动物疾病模型，a， 28、转基因动物疾病模型1 .转基因动物和心血管疾病a .与动脉粥样硬化和脂质代谢

10、相关的LDL受体转基因动物可以增强对LDL的去除b. apoE3转基因小鼠增强对LDL的去除，变异的apoE诱发高脂血症，apoE4 2 .转基因动物在与高血压和血压控制相关的reninangiotensingeng转基因小鼠模型中出现高血压，为了研究ras (renin-angiotensin ogen system )各成分对高血压的作用和相互关系，a 由于一般实验动物对HBV不敏感，发现能感染HBV的动物只有灵长类，所以研究HBV的致病机制用动物实验方法很难。 HBV转基因小鼠的建立为探讨HBV的致病机制提供了有价值的动物模型4 .转基因动物和肿瘤研究转基因小鼠肿瘤模型能很好地模拟体内的

11、生理、病理环境，与应研究的肿瘤发生过程比较一致，且部分癌前病a，30，(三)生物制药，1 .细菌细胞2 .酵母细胞3 .昆虫细胞4 .哺乳动物细胞5 .动物乳腺反应器，a，31，动物乳腺反应器是指利用动物乳腺特异性启动子控制元件指导外源基因在乳腺中的特异性表达，能从转基因动物乳汁中获得重组蛋白质的生物反应器特征：1.对转基因动物的影响小2 .产量大、产品容易精制、质量高3 .表达产物的生物活性稳定4 .容易扩大、规模化生产5 .缩短新药的发售周期6 .可获得巨额的经济效益，a，32，(4)遗传1 .基因治疗(gene therapy )是将外源性功能性目的基因导入患者体内，通过控制目的基因服刑

12、人的表达来抑制、替代、补偿缺陷基服刑人，恢复细胞、组织、器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法2 .治疗方法： (1) 基因直接注射法(in vivo ) :将保存外来DNA的病毒、脂质体或暴露的DNA通过静脉或肌肉直接注入患者的相关组织，并将其放入相应的细胞中使之表达。 (2)体外基因回归体内的方法(ex vivo ) :在体外培养患者体细胞(t淋巴细胞等)，导入外来目的基因后再回到患者体内。 基因治疗策略(1)基因置换(2)基因失活(4)免疫基因治疗(5)激活前体药物基因治疗(6)抗药性基因治疗，a，34，(5)RNAi技术，thenobelprizeinphysiologyormed

13、icin RNAi的早期研究和理论形成二，参与RNAi的重要分子三，RNAi作用机制，a、36，一，RNAi的早期研究和理论形成，(一)，RNAi的早期研究一，牵牛花实验1990年，Arizona大学的Rich教授在转基因实验室将紫色素基因导入矮牛花植物中，生成紫色素结果意外地，无法增加花瓣紫色着色，转基因花全部变白，部分出现白花，色素的合成不是增加，而是减少了。 事实上，不仅导入的基因没有表达，植物本身的基因也失活或在一定程度上受到限制。 这种现象被称为共抑制(cosuppression )现象。a，37，2 .秀丽线虫实验，1995年，Cornell大学苏郭和Kemphues试图用反义RN

14、A技术特异性阻断秀丽线虫par-1基因的表达，研究其功能。 将par-1的反义RNA注射到线虫中后，发现其基因的表达如预期地被阻断。但是，向对照组注射正义RNA，观察该基因的表达增强，结果发现par-1基因也受到抑制。 a，38，3 .粗脉孢子菌实验，1997年，意大利Cogoni等人把外源胡萝卜素基因导入真菌粗脉孢子菌中(结果，转化细胞的内源性胡萝卜素基因也被抑制，该基因的失活被称为抑制(quelling，基因抑制)。a、39、早期3个实验、牵牛花实验和粗脉菌实验已经取得了有意义的结果，但还没有继续研究。 其中秀丽线虫实验最有意义的是，在该实验中给线虫注射了正义RNA和反义RNA，但没有注射

15、结合两者的双联RNA。 RNAi理论的形成是基于后者。a，40，(二) RNAi理论形成，1. RNAi理论2. RNAi概念，a，41，发现RNAi，双标准RNA，inject，C. elegans，neg .控制un injected， 安全RNA dsrna传感器、安全、nature1998、393939:806-811、MEX-3 使用sRNA和dsRNA研究结果令人吃惊的是，dsRNA的抑制效果比单一意义和反义效果更有效，诱导基因沉默的效率高10倍。 少量的dsRNA处理线虫后出现基因沉默现象，这种抑制现象也传到了第二代。 a，43，2.rnai的概念，rnai是指，几个小双链RNA序列被导入生物或细胞，在生物或细胞中具有相同序列的基因的表达被有效地特异性抑制或阻断(沉默)，RNAi作用在转录后水平上发生， (1)参与转录后基因沉默(PTGS )，a，44，2.ran干扰的重要分子，(1)Dicer酶(2)RISC(3)rdrp和mRNA，a，45，(1) d dicer酶促进将RNase III家族中特异性识别双链RNA的成员dsRNA分解成小片段RNA的重要因素有： a，46，(