青岛农业大学-分子生物学实验考试

1、实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化一、 实验目的 1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法2、解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义，学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。二、 实验原理1、 感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 所谓的感受态，即指受体（

2、或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保存（有效期6个月）。2、 转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法

3、，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp )，理论上只有转入了pUC19质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基上生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此尚需提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定

4、。三、 实验材料、设备及试剂1、实验材料 大肠杆菌单菌落液体培养物2、实验设备及器具1、 低速冷冻离心机、超净工作台、50 ml 离心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。恒温水浴箱 恒温摇床 无菌离心管 标记笔 玻璃涂布器 微量移液器3、试剂及配置0.1 M氯化钙溶液（配制：称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml双蒸水中，定容至100 ml, 转移至试剂瓶中，121 灭菌20 min，保存。75%乙醇1LB培养基 液体培养基：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）氯

5、化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体培养基：100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉含氨苄青霉素（Amp）50mg/l的固体LB培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手时加入Amp铺培养皿。pUC19质粒 配制成约50ng/l。四、 实验步骤操作步骤一. 感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)1、 从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37200rpm12-16h，可过夜培养。2、 将活化菌体按15接种到LB中，扩大培养37200rpm2h，至OD600约为0.4。3、 取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，

6、4 离心8 000rpm1 min。 4、 弃上清，加500 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4冷冻离心8000rpm1 min。5、 彻底除去残液, 加200 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。6、 冰浴静置 30 min ，4冷冻离心8000rpm1 min。7、 弃上清，加100 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。附注：、 整个过程注意无菌操作和保持低温。、 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。、 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。、 LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培

7、养基，检查菌体是否污染。、 D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.4 - 0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。二、质粒对大肠杆菌的转化1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。2、42热激90S。3、迅速冰浴3min。4、加入300 ul LB液体培养基，37轻摇培养45min。5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混匀。6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨苄的LB固体培养基中。7、37倒置，避光培养16-20 h。8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。转化实验本应设置两

8、个对照： 对照组1 用来判断不加入质粒的大肠杆菌在抗性培养基上生长的状况，排除假阳性对照组2 用来判断制备成感受态后的大肠杆菌在普通培养基上的生长状况五、计算转化率 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数（CFU）可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数涂板前离心管中菌液体积涂板时所用菌液体积转化频率 转化子总数质粒DNA加入量(mg) 转化效率转化子总数感受态细胞总数 注意：实验从第三步开始，整个实验过程都必须无菌操作！五、思考题1、用试剂瓶盛装的氯化钙在灭菌时应怎样操作？答：可以高温高压灭菌，也可以过滤灭菌。高温高压灭菌注意盖子不要盖得太紧。2、步

9、骤3和4中，对离心机应当做什么样的预处理？答：由于整个实验都应在低温下进行，因此需要对离心机进行4 的预冷。3、实验为什么必须全程在无菌条件下操作？答：防止杂菌和杂DNA的污染。否则会影响转化效率或杂DNA的转入。实验二 质粒DNA的提取目的学习碱裂解法提取质粒的原理原理质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆

10、菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。试剂与器材一、

11、 试剂1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5。高压灭菌20min。2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。3、溶液：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。4、溶液：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须现配）5、 溶液：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1L乙酸钾 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水 28.5mL）。6、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1

12、mmol/ L EDTA。7、无水乙醇和70%乙醇。二、 器材1、 Eppendorf管、离心管架2、 10，100，1000 ul微量加样器3、 台式高速离心机4、 摇床、高压灭菌锅5、 大肠杆菌DH5（含质粒）操作步骤一、 培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，3724h， 然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，3712h。二、 提取步骤1、将菌液移入1.5ml 离心管，8 000 rpm1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。2、加入100 ul预冷的溶液，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。3、加入4 ul RNase ，室温2 min。4、加入200 ul溶液，快速颠倒

13、，温和混匀，冰浴5min。此时溶液应非常粘稠。5、加入150 ul 预冷的溶液，温和混匀（此时应有可见沉淀），冰浴5 min。6、12 000 rpm5min。转移上清液至另一1.5ml离心管中。7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-2020min。8、12 000 rpm5min，彻底除去残液。9、加入500 ul 70% 乙醇洗DNA沉淀。3 000 rpm1 min，彻底挥发除去乙醇。10、加入40 ul ddH2O溶解DNA，待用。（或用TE溶解，-20保存）。实验三 紫外吸收法测定核酸浓度与纯度一、实验目的： 1、了解紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理2、熟悉分光光度计的

14、操作；3、计算DNA含量，学习核酸浓度的定量技术。二、实验原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，在240290nm的紫外波段有强烈的吸收峰，DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（absorbance）以A260表示。A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度计通过测定核酸溶液对光的吸收确定核酸的浓度和纯度。但不能区分DNA与RNA的含量。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如果混杂有蛋白质或苯酚，A260/A280比值会明显

15、降低。通常在A260nm波长下，以1OD值相当于50gmL双螺旋DNA，或40gmL单链DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸加以计算。此法操作简便，迅速。但若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故为了测定准确应设法预先除去。三、试剂与仪器设备：DNA样品；灭菌双蒸水（ddH2O）紫外分光光度计；狭缝石英比色杯；微量移液器、加样枪头四、实验步骤1、接通紫外分光光度计电源，使仪器处于紫外测定状态下预热20min；2、调波长至所需，吸取1ml ddH2O至石英杯中调节分光光度计零点；3、倒掉ddH2O，在石英杯中加入已稀释好的DNA样品溶液，进行相应波长下的光吸

16、收值的测定；4、测定完毕，将石英杯中的样品溶液回收回指定的容器中；5、用洗瓶洗涤石英杯，再重复2-4步骤进行第二个波长下的光吸收值的测定；6、通过测定的260nm和280nm的OD值，计算A260/A280比率。比率1.6说明DNA纯度较高；7、计算样品的浓度双链DNA浓度=50g/mlA260稀释倍数单链DNA浓度=33g/mlA260稀释倍数单链RAN浓度=40g/mlA260稀释倍数核酸总量=样品浓度样品体积（ml）五、实验结果分析所测样品纯度，可能含有的杂质，样品DNA大致的浓度。实验四 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA目的学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量

17、以及分子量的大小。原理水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需510ng DNA ，就可以从照

18、片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.010.1ng的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。当提取到的质粒D

19、NA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。试剂与器材一、 试剂1、 DNA样品2、 TBE缓冲液（5）：用时需稀释10倍3、 点样缓

20、冲液Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。5、 琼脂糖二、 器材1、 电泳仪系统2、 紫外灯3、 恒温水浴箱操作步骤1 选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。2 选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.51.0mm。3 制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：琼脂糖的含量（%）g/ml分离线状DNA分子的有限范围(kb)0.36050.6

21、2010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。4 将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60 左右时，在凝胶溶液中加EB（EB最终浓度为0.5 g/ml），摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5。5 待测的DNA样品中，加入1/5体积的点样缓冲液，混匀后小心的进行点样，记录样品点样顺序和点样量

22、。6 开启电源开关，最高电压不超过5V/cm。7 电泳时间看实验的具体要求而异，在电泳中途可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后电泳结束。一般20min3 h，取电泳凝胶块直接拍照。实验三 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA一、实验目的： 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以

23、分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。三、试剂与仪器设备：1. 质粒DN

24、A2. 琼脂糖3. 6载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油450TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。5溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5l贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5g/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。6. DNA Marker：共6条带，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng7各种国

25、产移液器(10，20，100l)8消毒的tips枪头9水平电泳槽和电泳仪四、实验步骤1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶

26、时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4、加样：取1l DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。质粒DNA加样完毕，选取一个未加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/

27、cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约21cm时,停止电泳。 6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。注意 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。五、实验结果分析质粒DNA电泳条带的形态。根据DNA marker分析质粒DNA溶液大致的浓度。六、思考题1、电泳时所加电压值如

28、何确定?答：可根据DNA大小来确定，越大的电压可低点，避免拖尾现象；越小的电压可适当大一点缩短电泳时间，避免时间过长DNA扩散导致条带模糊。2、就你的理解，DNA marker的用途是什么?答：分析DNA大小和浓度的依据。3、电泳中用到两种buffer，各自的作用。答：上样缓冲液主要作用： （1）螯合Mg 2，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。 （2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。 （3）指示剂监测电泳的

29、行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。电泳缓冲液的作用：一是维持合适的pH；二是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。 此外，电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。 4、如果质粒DNA电泳条带只有一条，说明提取的质粒质量高还是低，为什么？答：质量高。这说明产生只有超螺旋的正常质粒闭合环双链DNA。实验五 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性

30、末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。质粒DNA在细胞内有三种构象：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，

31、质粒在电泳中呈现23条区带。试剂与器材一、试剂1、EcoR酶2、DNA3、TBE缓冲液（5）：用时需稀释10倍4、 点样缓冲液Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6、 琼脂糖二、器材1、电泳仪系统2、紫外灯3、恒温水浴箱操作步骤一、 质粒DNA酶切管号质粒DNA101010EcoR/ ul11酶切Buffer（10）/ ul222ddH2O/ ul876RNA酶11、 按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。2、 加样后混匀，置于37水浴中，保温2 h。

32、然后每个管中迅速加入2 ul EDTA终止反应。二、 琼脂糖凝胶电泳1、 琼脂糖凝胶的制备（1）称0.4g琼脂糖加40ml 0.5 X TBE缓冲液,加热熔解。冷却至60加2 ul EB，混匀。2、 胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，然后倒入熔好的琼脂糖，并在一端插好梳子。待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽，垂直拔掉梳子。注意：电极缓冲液要高出凝胶面2-5。3、 加样每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10），混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。4、 电泳观察接通电源，电压为80V1h左右，当溴酚蓝到达下沿1-2处时，停止电泳。5、 观察及照相

33、将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。实验六 质粒DNA的限制性酶切、PCR扩增与检测一、实验目的 掌握PCR、限制性内切酶酶切的技术原理和操作要点，增进对理论知识的理解。二、实验原理1、限制性内切酶酶切 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸

34、酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割产生平末端的DNA片段，有的切割位点在对称轴一侧产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶

35、时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶,消化1-2小时。2、PCR PCR即聚合链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特异性DNA 的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA

36、聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达21067拷贝。3、琼

37、脂糖凝胶电泳 参见实验三。三、实验材料、设备及试剂1. 上下游引物: 浓度为各10 pmol/l。 5 AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3, 5 AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3， 2DNA模板：大豆基因组，浓度为100ng/l。410buffer（购买Taq酶配套buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 1005MgCl2：25mmol/L。6dNTP 2.5mmol/L：分别取等体积的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合

38、即成7Taq DNA聚合酶：浓度为2.5 U/l。8灭菌双蒸水9. 10X buffer（购买限制性内切酶配套buffer）10. SalI限制性内切酶：10U/ul11. 质粒DNA：200ng/5ul12. 6载样buffer：0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油1350TAE 电泳Buffer： 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。14溴化乙锭(EB)溶液：10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5l贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5g/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，

39、避免污染环境。15. DNA Marker 16各种国产移液器(10，20，100l)17消毒的0.2ml、.ml PCR管，10l，100l tips18恒温水浴锅19PCR仪20水平电泳槽和电泳仪四、实验步骤（一）PCR：各种试剂置冰盒中，取已灭菌的0.2ml PCR管，于冰上按下表操作（注：根据质粒浓度来决定质粒模板的加入量）：反应体系配制（10l体系）试剂加入量终浓度(或含量)DNA模板1l100ng10buffer2l1bufferdNTP1l2.5mmolMgCl20.5l约2.5mM/L上下游引物1l（各10 pmol/l）各10pmolTaq DNA聚合酶0.5l (2.5 U

40、/l)1.25U无菌ddH2O补足20l总体积10l 用枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，编号。于PCR仪上进行PCR反应。反应程序设置为：94 预变性 5min 以下35次循环 94 变性 55S 55 退火 45s 72 延伸 55s 最后 72 7min（二）限制性内切酶酶切：试剂加入量终浓度(或含量)质粒DNAxl500ng1ug10buffer1l1bufferSal I0.1l(10 U/l)1U无菌ddH2O补足10l总体积10l 注：加入质粒DNA溶液的体积根据实验五电泳结果决定，取的体积保证加入的质粒为500 ng1ug即可。加盖，混匀后稍离心，37水浴反应3h。反应完毕，于8

41、0水浴20min使酶失活。 （三）琼脂糖凝胶电泳 步骤略，请自行设计实验步骤。五.实验结果分析由琼脂糖凝胶电泳结果分析PCR结果如何？限制性内切酶酶切结果如何？预期应是怎样的电泳结果？如果电泳结果与预期不符，请分析原因。实验二 碱裂解法小量提取质粒DNA一 实验目的了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。二 实验原理本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用

42、酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。三 实验材料转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5系列菌株四 实验设备微量取液器(100l,1000l)， 台式高速离心机五 试剂溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。溶液：0.2 mol/L NaOH 、1 SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2 SDS母液稀释)。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.