镍柱纯化原理及方法

1、镍柱亲和色谱亲和层析的原理：利用分子间的特定相互作用，它们可以特异性地可逆结合，这种结合力称为亲和力。具有特定亲和力的普通生物分子对：酶：基质类似物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞细胞：细胞表面特异性蛋白，凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞在文献中，固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质共价结合形成亲和色谱的固定相，称为亲和吸附剂。配体通过共价键与活化的基质结合形成固体载体。一般载体有琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素。咪唑环：是1，3-二氮杂环，英文名称是咪唑。如果氢原子的剩余部分从第一个或第

2、三个氮原子上被除去，它被称为咪唑基。它是咪唑的一部分，在除去与氮原子直接相连的氢原子后留下组氨酸的性质：疏水性弱，咪唑环为弱电。金属离子：过渡金属离子如Cu2、Ni2、Zn2和Co2能与电源原子如氮、硫和氧产生配位键，因此它们能与蛋白质表面组氨酸的咪唑基(His)、半胱氨酸的巯基(Cys)和色氨酸的吲哚基(Trp)发生亲和结合，其中His的咪唑基具有最强的结合作用。过渡金属离子与咪唑基的结合强度大小顺序为Cu2 Ni2 Zn2 Co2。镍离子：有六个螯合价格点，镍柱通常分为镍-NTA和镍-伊达。镍-NTA螯合物是四价的，仍然是二价的。而镍-IDA螯合三价，留下三价。因此，镍-IDA琼脂糖的结合

3、力比镍-NTA琼脂糖强。在相同条件下，镍-IDA琼脂糖的负载量高于镍-NTA琼脂糖，用于洗脱杂质和靶蛋白的缓冲液中咪唑的浓度较高。然而，镍-NTA更稳定，对还原剂更有抵抗力，镍离子不太可能脱落。因此，有必要根据不同的净化条件选择镍柱进行净化，以达到最佳的净化效果。矩阵：不溶性多孔网络结构，渗透性好；物理化学稳定性高，机械强度高，使用寿命长；(3)抗微生物和酶的侵蚀；优选粒径均匀的球形颗粒；亲水性和非特异性吸附；含有可活化的活性基团，有利于亲和配体的固定化。实例：琼脂糖凝胶微球的商品名是琼脂糖凝胶，当糖含量分别为2%、4%和6%时，称为2B、4B和6B。琼脂糖4B的结构比6B疏松，吸附容量比2B

4、大，因此4B被广泛使用。配体：一种能可逆结合特定分子或基团的分子，可通过亲和层析纯化。配体的选择受两个因素的影响：(1)配体和靶之间的结合必须是特异性的和可逆的。(2):它必须有化学修饰基团，这样它才能被吸附在基质上而不破坏其活性。间隔臂：靶蛋白的结合位点位于分子的深处。如果配体直接偶联到底物上，由于空间位阻，配体不能到达靶蛋白的结合位点，因此与靶蛋白的结合能力低。因此，在配体和基质之间插入间隔臂可以使结合更容易。间隔臂使结合最大化，同时避免非特异性结合。间隔臂的长度是关键，太短且无效；时间太长，会发生非特异性结合。一般规则：当偶联的分子量小于1000时使用间隔臂；当分子量大时，这是不必要的。

5、二硫键：蛋白质的二硫键形成于半胱氨酸残基的硫醇之间。二硫键通常在内含蛋白离开细胞后以氧化态存在。这个键在蛋白质分子三维结构的形成中起着重要的作用。为了确定蛋白质的一级结构，二硫键必须打开以形成一条线性多肽链。抽样方法：(1)直接抽样(2)间接抽样洗脱方法：(1)酸碱度洗脱：酸碱度的改变可以改变带电配体基团和结合蛋白的电离度，降低其结合位点的亲和力。(降低酸碱度的方法)(2)离子强度洗脱：(3)竞争性洗脱：(咪唑)再生：(1)用强变性剂6M盐酸胍洗涤柱(2)用水冲洗干净(3)用0.2% SDS冲洗色谱柱(4)用水冲洗干净(5)用50%乙醇洗涤柱(6)用水冲洗干净(7)用100毫米乙二胺四乙酸(5

6、0毫米Tris 100毫米乙二胺四乙酸，pH 8.0)冲洗色谱柱(8)用水冲洗干净(9)用100毫米硫酸镍孵育色谱柱(10)储存在4的20%乙醇中上清液缓冲液和配方上清液纯化缓冲液公式裂解缓冲液50毫米三盐酸；150毫米氯化钠；20毫米咪唑；pH8.0洗脱缓冲液150毫米三盐酸；150毫米氯化钠；50毫米咪唑；pH8.0洗脱缓冲液250毫米三盐酸；150毫米氯化钠；100毫米咪唑；pH8.0洗脱缓冲液350毫米三盐酸；150毫米氯化钠；300毫米咪唑；pH8.0包涵体缓冲溶液及配方包涵体纯化缓冲液公式IB裂解缓冲液120毫米Tris150毫米氯化钠；2mM乙二胺四乙酸；2mMDTT1%海卫一X

7、-100；PH8.0裂解缓冲液250毫米三盐酸；150毫米氯化钠；8尿素；pH8.0IB洗脱缓冲液150毫米三盐酸；150毫纳克。20分钟左右；8尿素；pH8.0IB洗脱缓冲液250毫米三盐酸；150毫纳克。50毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脱缓冲液350毫米三盐酸；150毫纳克。100毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脱缓冲液450毫米三盐酸；150毫纳克。300毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脱缓冲液550毫米三盐酸；150毫纳克。500毫米左拉；8尿素；pH8.0试剂及其功能1.TritonX -100 (triton x-100)具有亲水端和疏水端，能从细胞膜上解离膜蛋白以提取膜

8、蛋白。常用的非离子洗涤剂。用途：1%-3%TritonX -100。2.TCEP (tris (2-羧乙基)膦)是一种非常有效的硫醇还原剂，在蛋白质化学和蛋白质组学研究中广泛用作二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中具有良好的稳定性和溶解性。在酸性和碱性溶液中的稳定性也很好。与DTT等硫醇还原剂相比，TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在一些巯基交联反应中也不需要除去。剂量：1毫米/毫升。3.胃蛋白酶抑制剂：能抑制酸性蛋白酶，溶于甲醇，不溶于水。剂量：1微克/毫升。储存在：-4(一周)/-20(半年)。4.亮肽素：它能抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，在制备过程中溶于水。剂量为1微克/毫升。储存在：

9、-4(一周)/-20(半年)。5.乙二胺四乙酸：螯合剂，可消除痕量重金属对酶催化反应的抑制。干扰金属离子可以在不影响蛋白质功能的情况下被去除，但同时金属蛋白酶的活性可能会丧失。剂量：0.1-5毫摩尔/升6.甘油：增加粘度，减少分子间碰撞，用量：5%-30%。7.十二烷基硫酸钠：能使蛋白质变性的阴离子洗涤剂，用量：0.1%-1%。8.TritonX -114:当温度高于22时，在蛋白质溶液中加入2%的TritonX -114可以将蛋白质从洗涤剂相和液相中分离出来，而可溶性蛋白质处于液相，膜蛋白进入洗涤剂相。(内毒素存在于细胞壁成分中，在细菌裂解后释放出来。)9.二硫苏糖醇：通常用于减少蛋白质中的二硫键，并可用于防止蛋白质中半胱氨酸之间形成分子内或分子间二硫键。然而，DTT通常不能减少蛋白质结构