第三课-分子诊断-刘斌.ppt

1、分子诊断在病理诊断中的应用,兰州军区总医院病理科刘斌,肿瘤的发生根本原因是由于基因的异常改变引起。随着分子生物学的发展，特别是人类基因组计划的顺利实施、人类基因组序列的剖析、相关基因功能的识别，对肿瘤的发生、发展及转归机制有了更深入的了解，使人类除了能更早期发现及诊断肿瘤外，还可预测人群或个体发生肿瘤的风险（肿瘤易感性）、病因检测、肿瘤的恶性特征、对特定治疗手段的反应（疗效预测）、转移复发的可能与早期发现等，进行肿瘤诊断、分类、判断预后及指导治疗。,如今检测癌患者的基因状态有很多方法：IHC，FISH，CISH，SouthernBlot，PCR，RealTimePCR。现如今FISH技术已应用

2、于实体瘤、血液肿瘤、产前产后多个领域。,荧光原位杂交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况,FISH,FISH检测类型,基因过表达的检测基因突变及其检测基因的易位与重排染色体数目的检测端粒酶与肿瘤的关系检测,一.基因过表达检测,1.对HER2的检测,其中FISH是FDA批准的方法，被誉为“金标准”。,ICH,赫赛汀,FISH技术对HER2基因的检测HER-2基因为致癌基因，位于17q11.2-q12可编码

3、跨膜蛋白，基因有扩增的乳腺癌对三苯氧胺不敏感。HER-2基因扩增是决定Herceptin是否有效的关键性指标。,赫赛汀(Herceptin)抗肿瘤机制,乳腺癌和胃癌中HER2基因的扩增比率,所做乳腺癌中HER2基因检出阳性率为65%；胃癌中HER2基因检出阳性率为35.7%。,2.非小型细胞肺癌中EGFR基因扩增的检测,EGFR扩增,EGFR无扩增,NSCLC中EGFR基因扩增,鳞癌扩增为80%左右，腺癌与大细胞癌为60%左右基因扩增能引起EGFR酪氨酸激酶活化，激发其下游一系列信号传导途径，促进肿瘤发生发展，基因扩增与酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关基因扩增病人用药有效率达38.9%，无扩增的病

4、人用药有效率在9.8%,EGFR功能EGFR在多种上皮性肿瘤高表达,其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关,最终导致细胞的转化、增殖,抵抗细胞凋亡、促进细胞生存,与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关。,抗凋亡,ATP,EGFR变异,目前应用于NSCLC的靶向治疗药物,吉非替尼(gefitinib,ZD-1839,商品名Iressa2003FDAapproved)厄洛替尼(erlotinib,OSI-774,商品名Tarceva2004FDAapproved)西妥昔单抗:(cetuximabFDA2004approved),二.基因突变及其

5、检测,Real-time检测基因突变原理,TaqMan探针的机理:DNA聚合酶在延伸阶段把探针切碎，产荧光基团和荧光淬灭基团分开，于是荧光得以检测。,EGFR基因突变,突变率在33%左右，其中腺癌高达48%（董强刚等2006）东方亚裔明显高于高加索人种、女性高于男性、非吸烟高于吸烟EGFR19、21外显子的突变占95%左右EGFR变异使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些关键基团发生重构,使得小分子酪氨酸激酶抑制剂更易与之结合，增强了与ATP竞争性抑制剂的相互作用全球突变型NSCLC用Iressa/Tarceva有效率约80%；无突变NSCLC用ressa/Tarceva有效率约10%。,R

6、eal-time检测EGFR19、21突变,K-RAS基因突变的检测,KRAS基因属于RAS家族的一员，包括K-RAS,N-RAS,H-RAS具有GTP酶活性，活化状态与GTP结合，失活与GDP结合，绝大部分细胞是与GDP结合的非活化状态参与调节细胞生长、增殖、分化与凋亡15-20%的NSCLC存在RAS基因突变，其中90%以上是K-RAS突变，12号密码子的突变占80%以上。而腺癌的病人突变占30%，K-RAS突变与吸烟密切相关，终生未吸烟的未发现K-RAS基因突变与EGFR基因突变存在排斥性是Gefitinib与Erlotinib原发耐药的分子标记之一,在直肠癌中K-ras基因突变的患者不

7、会从EGFR单抗靶向治疗中获益，K-ras野生型患者对cetuximab/Erbitux（爱必妥）和panitumumab/Vectibix（维克替比）单药或与基础化疗联合治疗的反应率显著大于突变型患者。,野生型,现临床通常将EGFR和K-RAS基因联合检测，来针对非小细胞肺癌进行靶向治疗，对拟行TKI治疗的患者，可以首先检测KRAS突变状态，排除阳性后对KRAS阴性者进行EGFR突变检测；若EGFR突变阳性，选择TKI治疗。,三.基因的易位与重排,1.慢性淋巴细胞白血病（CLL）检测通过对P53、RB1、D13S25、ATM基因以及12号染色体检测来判断预后。,2.慢性粒细胞白血病（CML）

8、检测BCR/ABL融合基因1.辅助诊断CML2.指导格列卫用药3.药物使用效果评估4.骨髓移植效果评估,BCR/ABL基因融合,正常细胞,3.急性早幼粒细胞白血病（M3）检测PML/RARA融合基因。指导全反式维甲酸(Alltrans-retinoicacid，ATRA)用药ATRA治疗机制是靶向降解PML/RARA融合蛋白，促进阻滞在早幼粒细胞阶段的白血病细胞分化成熟。,PML/RARA融合基因,正常细胞,3.性染色体骨髓错配移植检测用于监测性染色体错配的骨髓移植效果,女性患者骨髓移植前女性患者骨髓移植后,四.染色体数目的检测,不明原因流产中较为常见的有X单体，发生率约为20%；16号三体，发生率约为16%；18号三体，发生率约为3%；21三体，发生率约为5%；22三体，发生率约为5%。进行染色体检测可以为下一胎妊娠遗传咨询提供资料。,21三体,13三体,其它项目,一.基因重排在淋巴瘤诊断中的应用它在淋巴瘤的分型、疗效评价、预测复发和预后评估等方面有重要的临床意义。二.端粒酶与肿瘤的关系检测由于TERC（telomeraseofRNAcomponent）基因编码端粒酶的RNA组分，维持端粒的长度，该基因的扩增使得端粒稳定，阻止细胞凋亡，导致肿瘤产生。当病理检测不能明确患者分级的情况下