DB13T 434-2000 甘薯脱毒种苗培育及生产规程

B05河北省地方标准甘薯脱毒种苗培育及生产规程2000-04-29发布2000-05-01实施河北省质量技术监督局发布本标准由河北省农林科学院提出。本标准由河北省农林科学院昌黎果树研究所、秦皇岛市甘薯研究开发中心起草。1范围2引用标准3.4网室隔离以40目以上尼龙网建成的带有1.5m进深缓冲间的网棚。4应脱除的病毒甘薯羽状斑驳病毒SweetpotatofeatheryMottleVirus(SPFMV)河北省质量技术监音局2000-04-29批准2000-05-01实施5.1脱毒5.1.1外植体选定5.1.2外植体灭菌用75%酒精浸搅90s,取出后，再用0.1%升汞(HgCl₂)灭菌7min,随即用无菌水冲洗3次以上，放在垫有滤纸的培养皿中，在加皿盖保鲜条件下，在解剖镜下切取0.2mm-0.3mm大小的茎尖(不多于2个叶原基),迅5.1.4培养条件5.1.5热处理当试管苗长到4-5片展开叶时，将其移至38℃±1℃的条件下热处理养条件同5.1.4。5.1.7建立单株(系)当单株(系)的试管苗展开叶达6片以上时进行。按株(系)取样，保留每株的顶芽和带1个基部芽的原株继代。中部材料用NCM-ELISA初检，淘汰呈阳性反应的单株(系)。通过初检的单株(系)继续扩繁。检测方法见附录A(标准的附录)。5.2.2指示植物检测确认通过NCM-ELISA的阴性株(系)继续扩繁，在单株(系)有10株以上时，外移7株-8株。待恢复生长、每株形成10片叶以上时，同巴西牵牛嫁接。每单系接5株，以3株成活用于观察有效。检测方法见附录A(标准的附录)。5.3试管苗生产5.3.1组培快繁将最终确认已脱除病毒的保留株(系)进行组培快繁。采用侧芽增殖路线，以避免出现愈伤组织及由其形成的不定芽，即每次继代均切取带1-2个芽的茎段，在试管内微扦插。培养条件同5.1.4。5.3.2试管繁殖的时期控制5.3.2.1冀东地区：用于春栽时(5月上旬),应于3月1日后进行试管内锻炼(在自然光、温条件下进行，外移前2d-3d逐渐打开瓶盖),为期1周，4月1日前移栽于有隔离网的温室。经扦插扩繁后，于5月上旬栽植于露地网用于夏栽时(7月中旬),应不晚于5月1日进行试管内锻炼，6月1日前移栽于隔离温(网)室。经扩繁后，于7月中旬栽植于露地网室。5.3.3试管苗外移及管理用营养钵(高10cm,直径6cm)单株移栽，用疏松肥沃的营养土(园土：蛭石：腐熟有机肥=6:3:1)。外移操作严防植株机械损伤。外移之初，棚内温度不低于15℃,白天不高于28℃,空气相对湿度不低于75%。同时注意防病、防治地下害虫。缓苗成活，发出新根后，控温降湿。当植株长至10cm、有5片展开的健壮叶片时，放风锻炼。一般经7d-10d即可剪蔓并按株系分行、段栽入露地网室继续进行扩繁。5.4露地网室栽植及管理5.4.2土壤准备露地网室以南北向为宜，跨度8m-10m,高度3m-3.2m,长度按栽植5.4.8.2及时除草。网室内于薯秧封垅前除草2-3次；网室外距网2m内5.4.8.6夏薯生长中后期提蔓2次，防止徒长。5.5.1为提高种薯质量，收获期可稍迟于露地种薯，以网室内地面气温不低于15℃时为准。5.5.3按品种株系分袋包装，每袋内、外分别系好标签，防止混杂。5.6.1核心原种应专窖贮藏，并于收获当日人窖。5.6.2种薯入窖后，利用自然低温，降低窖温至12℃±1℃。并依次于入冬5.7品种及其生产性能鉴定对经验测已确认脱毒的株(系),通过继代培养、锻炼后，移入核心原种网室进行栽培观察认定。在团棵期及秋季收获时，进行品种种性鉴定并测定淀粉含量(淀粉型品种)及其单位面积产量，从中选出符合其品种特征特性的最优株系，以用于原原种的扩繁。6原原种6.1繁育原原种的基本条件及种薯的一般标准6.1.1用于繁育原原种种苗(薯)的繁殖材料，必须是省级指定的专责单位繁育的核心原种。6.1.2原原种的生产必须在隔离网室内进行。6.1.3网室生产的种薯，必须符合本品种的典型性状，单薯重量以100g-200g为宜。6.2原原种育秧及苗床。6.2.1加温火炕、电热温床及利用太阳能的冷床均可繁育种秧。6.2.2苗床设置在隔离网室内，防虫措施见5.4.8.2、5.4.8.4。6.2.3育苗时采用稀排薯，改拔秧为剪秧。7.1繁育原种的基本条件7.1.1用于繁育原种的繁殖材料，必须是经省(或市)级主管部门批准的原原种繁育单位的原原种苗。7.1.2原种生产的空间隔离寄主植物及黄花植物。7.2传毒昆虫的防治当地蚜虫发生季节，每周喷1次防蚜农药，其它季节每两周喷药1次。7.3去除带毒显症株及杂株7.4原原种及原种的育秧及田间管理，除上述要求外，其它与常规生产管理相同。8脱毒种苗生产的程序8.1种苗产地的条件8.1.1种苗画地的选择按GB7413-87中的4.1执行。8.1.2凡准备生产原原种、原种的单位和农户必须分别向所在地的市、县申报单位(农户)繁殖地点种薯级别隔离条件主管机构审批意见8.1.6原种以下级别的种薯(即生产种)由农户自行繁育，繁育条件参8.2脱毒种苗的育繁8.2.2原原种生产单位所用的种苗必须由省级指定的甘薯脱毒种苗繁育8.2.3原种生产单位所用种苗必须是原原种种苗，其生产程序由所在地8.3.1病毒病以外的病虫害防疫按GB7413-87中的4.3执行。的5.4执行。9.1报检的种苗不带有GB7413-87所规定的检疫对象和控制病害。法见附录A(标准的附录)。9.3原原种的检测由省级指定的甘薯脱毒种苗检测专责单位进行。9.5脱毒甘薯各级种苗生产单位(农户)报检时需填写“送检样本检测申报送检时间标本编号种薯级别种薯面积注：核心原种按系号，原原种按网棚号，原种申报表1式2份，1份交送检测部门、1份留申报单位(级次重复次数判断依据标准核心原种指示植物各脱毒试管单系并编号5株/单系2物叶片有明状0除。原原种硝酸纤维膜一酶联免疫吸附以网室为单位均匀取样5株为1组000株/亩2物检测确认脱毒的植株指示植物NCM-5段茎段(1芽/段)2同核心原种0如有显症应允许带毒株率的原种依隔离区自10株为1组100组1000株/100亩2同原原种经前步检测该组单株分别取样阳性组：10株/组2(含5%)9.7出证：由承检单位签发“脱毒甘薯种苗检测报告”,见表4。表4脱毒甘薯种苗检测报告送检日期检测报告单编号检测结果血清学检测指示植物检测符合种苗级别(盖章)(签字)A1.1.1TBSpH7.5(以2000ml计):用1990ml蒸馏水溶解并用浓HCI(浓度37%)调pH7.5。用蒸馏水定容至2000ml。A1.1.3抗体缓冲液(以100ml计脱脂奶粉2g1000mlTBS中加入0.5mlTritonX用90ml蒸馏水溶解1.21gTris,0.58gNaC,0.1gMgCl₂·6H₂O后，用浓HC(浓度37%)调pH值至9.5,用蒸馏水定容至100ml。二甲基亚砜(70%)1.2ml二甲基亚砜(70%)1.2ml完全溶解后避光4℃保存。A1.2.1将待检测样品每一序号植株的上部、中部、下部叶片各分别收集在同1个塑料袋中并标记样品序号(必须在实验当天完成)。检测A1.2.2从每一序号植株的3片叶片上各取1个直径1cm的圆片。可将叶分研磨植物组织。室温下静置塑料袋30min-45min,直至植物汁液渗出。A1.3点样：处理硝酸纤维素膜时必须带手套并使用镊子。指印会造成假阳性反A1.3.1将1张干燥的滤纸放于实验A1.3.2用1个灭菌的干净吸管小心地吸取1滴样品袋中的上清液，滴在膜上方格的正中(上样时吸管尖端不能接触膜)。每个样品换1个干净吸A1.3.3重复步骤A1.1.3.2,直至加样全部完成。A1.3.4将膜转到1张干燥的滤纸上，干燥15min-30min。所有的孵育和冲洗步骤均在室温下完成。也时频率用50r,冲洗时用100r。A1.4.1加30ml封闭液(TBS+2%脱脂奶粉+2%TritonX-1泡。室温孵育60min。此时，取0.1ml微量离心管中的病毒抗血清，在烧杯中与30ml抗体缓A1.4.2弃去封闭液并用TBS迅速漂洗，然后加第一抗体溶液于培养皿A1.4.3弃去第一抗体溶液，在30mlT-TBS中，通过恒速振荡洗去未被同时用30ml抗体缓冲液(TBS+2%脱脂奶粉)稀释0.1ml微量离心管A1.4.5弃去酶标抗体溶液，如A1.4.3所述用30mlT-TBS洗膜，在最后1次洗涤时制备NBT/BCIP底物溶液(显色反应溶液)。分别用干净吸管各取0.075mlNBT和BCIP母液加到25ml底物缓冲液中(先加入NBT然后加BCIP)。剩余的NBT和BCIP母液放回4℃下避光保存。A1.4.6弃去最后1次的洗涤液，加入显色反应溶液。室温反应5min-30min。阳性反应表现出不同程度的紫色。如果在这段时间内没有可观察A1.4.7弃去显色反应溶液终止反应，将膜在蒸馏水中洗3次，每次A1.4.8将膜置于滤纸上干燥，保存时用2张干滤纸夹住。A2.1材料准备A2.1.1将待检测的脱毒处理过的甘薯试管苗盆栽于防虫措施良好的温室中，每1株系外移7株-8株，成活株数保证达6株以上。A2.1.2外移的试管苗生长1个月左右，具5片-6片叶时盆播指示植物——巴西牵牛(Ipomoeasetosa),花盆直径不小于10cm。每待检株系及阳性对照各需生长健壮的巴西牵牛5株。A2.2.1巴西牵牛生长1个月左右具3片-5片真叶，此时外移的待检甘薯苗具10片-15片叶以上时开始嫁接。稿。A2.2.3嫁接用接穗取自甘薯苗的中下部茎段，每个接穗带一个片。每单系嫁接5株，并做好相应