细胞学诊断检材的制备技术

细胞学诊断检材的制备技术一、细胞涂片、组织印片和压片的制备（一）涂片质量的基本要求1.将检材涂布于载玻片的右（或左）2/3处，另1/3部位粘贴标签。2.单向涂布检材，避免细胞变形。3.均匀涂布检材，涂片厚薄适当。4.红细胞过多的涂片，可酌情进行溶解红细胞处理。（二）涂片方法1.涂抹法：用棉签或针头将标本单向、均匀地涂抹于载玻片上。2.拉片法：将一滴检材置于一张载玻片上，再用另一张载玻片叠加其上并予轻压，再将该两张载玻片朝反向拉动，从而获得两张涂片。3.推片法：将一滴检液置于载玻片的右端，再用另一张窄边光滑的载玻片作为推片，并以与滴液载玻片成40°夹角、自右向左匀力推动检液，形成涂片。（三）痰涂片的制作1.送检的痰液应是由肺内咳出，最好是清晨空腹时自肺内深咳出的痰液。2.核查无误的收验痰液，应立即制作涂片（通常为2～3张）。3.用细签或无钩镊子挑取痰液置于载玻片上，并左右往复薄涂，随即投入固定液中。4.痰液中呈现下列性状的成分可能含有癌细胞，应注意挑取制作涂片：①血丝；②灰白色痰丝（形如白色细线，微细螺旋状，牵引时可伸长）;③透明痰液（可拉成较长细丝）。[及时在细胞学检查申请单上记录痰液性状]5.检查痰液中的肿瘤细胞，一般应连续送检3次。（四）黏膜、皮肤表面刮取（刷取、拉取）物和分泌物的涂片的制作1.阴道排出物、子宫颈刮取物涂片：通常由妇产科医师将已制作、固定后的涂片送交病理科检查。[注意由子宫颈外口上皮移行带刮取细胞涂片]2.支气管镜、胃镜等内腔镜的黏膜刷取物涂片（黏膜刷片）：刷片通常由内腔镜医师制作、固定后送交病理科检查。3.食管、胃拉网涂片：由食管拉出的套网气囊适量放气后，将气囊套网在载玻片滚动涂片，尤应将套囊上血丝、灰白色物制作涂片；涂片通常由有关临床医师将已制作、固定后的涂片送交病理科检查。套网中的小块组织可用来制作石蜡包埋切片。4.眼、耳、鼻、咽、口腔、皮肤等处病变（溃疡性病变等）的分泌物涂片。（五）液体涂片的制作液体标本（检材）包括乳头溢液、胸腔积液、腹水、尿液、胃液、脑脊液、穿刺液、冲洗液、灌注液等。除乳头溢液外，其他液体检材一般均应先行离心（2000r/min，10～20min）后，取其沉淀物制作涂片；液体检材也可用细胞涂片离心机（cytospin）直接制作细胞涂片。制作好的涂片应立即固定和染色。[及时在细胞学检查申请单上记录液体标本的性状和数量]液体标本的离心沉淀物较多时，将制作涂片后剩余的沉淀物固定于4%中性甲醛中1h，然后用擦镜纸或绸布将其包裹，制作石蜡包埋切片。1.乳头溢液：直接滴于载玻片上制作涂片。（1）患者乳腺触及肿物时：用手指自肿物远方沿乳腺导管引流方向轻力按模挤压，获取溢液，宜取中段溢液和血性溢液涂片。（2）患者乳腺未触及肿物时：可自乳晕周围向乳腺外周轻力按摩挤压，获取溢液。2.胸水和腹水（1）由患者体内抽取的胸腔积液或腹水应尽快送交病理科验收，检液量以200～500ml为宜。因故（例如远途）延时送达时，需在标本中加入40%的甲醛（加入量为送检胸腔积液、腹水量的1/5），或加入等量的50%乙醇－生理盐水。（2）胸腔积液、腹水的离心：采取容器底部的液体10ml（包括可能存在的沉淀物），移入离心管内进行离心。（3）离心后，倾去全部上清液，将离心管底部含有沉淀物的液体摇匀并用吸管吸出适量，滴注于载玻片上，制作涂片。3.尿液（1）制作方法同胞、腹水。（2）尿液含有胶状物时，应先将其除去。清除方法：用0.5ml/L氢氧化钠调节尿液Ph至6.0；离心后，倾去上清液，再向沉淀物中加入95%乙醇5～10ml/L（固定细胞），静置5min后加入蒸馏水并轻摇（溶去胶状物）；再次离心后，取沉淀物制作涂片。检查尿液中的肿瘤细胞，一般应连续送检3次。4.胃液、胃冲洗液：制作方法同胞、腹水。5.脑脊液（1）制作方法同胞、腹水。（2）脑脊液内细胞一般较少，可用微孔滤膜过滤法、沉淀法或纤维捕捉法收集细胞，制作涂片。6.冲洗液、灌洗液、穿刺液涂片的制作：参见上述的胸腔积液、腹水项。二、肿物细针穿刺物涂片的制备（一）实施细则针穿刺术前的准备工作1.实施细则针穿刺术的病理医师应先了解患者临床情况，向患者和/或患者授权人说明实施穿刺术的意义、局限性和其他相关问题等，取得患者和/或患方的知情和理解，并签署由各医院制订的《申请实施细针穿刺术细胞病理学诊断患方知情同意书》。2.合格的手术操作环境。3.必备的适用手术器械和其他相关设施。（二）肿物穿刺术的操作要点：1.确认肿物部位并估计其大小、与皮表距离和质地（实/囊性、硬度等），以指导穿刺的方向、深度和用力程度。2.必须严格实行无菌操作。3.根据肿物大小及其血供情况选择适用型号的穿刺用针头。穿刺用针头的外径为0.6～0.9mm，安置在2ml或10ml的一次性空注射器上。4.针吸法穿刺术操作要点（1）进行穿刺前，先将安装了穿刺用针头的空注射器管芯外拉2cm；然后，用手固定肿物，将安装在空注射器上的穿刺用针头刺入肿物（注射器内无空气）。（2）迅速上下提插注射器管芯10～20次（其间变换针头方向3～4次），遂使肿物不同部位的多余内容吸进入针头和注射器内。（3）将注射器与针头分离（管内负压因而解除）；随后，再将该注射器与仍插于肿物内的针头相接，拔出针头，穿刺结束。（4）迅速推动注射器的管芯，尽快地将位于穿刺针头内的少量吸出物排射在2～3张清洁的载玻片上，进行涂片。5.涂片方法：用针头将载玻片上的吸出物轻轻均匀拨开，或用推片法朝一个方向展开（不可双向往返推移）。6.吸出物过少时，可用向离心管内冲洗穿刺针头；再将冲洗液离心，然后取其沉淀物涂片[参见上述一（五）项“液体涂片的制作”]。7.吸出物较多时，可适量50%乙醇-生理盐水液将涂片后注射器和针头内剩余的吸出物冲洗至离心管中，离心后，取其沉淀物制作常规石蜡包埋切片。8.吸出物中含有细小组织块时，应将其制作常规石蜡包埋切片。9.内脏肿物穿刺时，必须在影像学检查的引导下用较长细针进行穿刺。10.穿刺操作完成后，即在细胞病理学检查单上书写穿刺记录。三、组织印片、压片的制备（一）组织印片：1.用锋利刀片剖开刚切取的新鲜肿瘤组织或淋巴结等，然后用清洁载玻片轻压于组织剖面处，将组织表面的细胞成分印在玻片上。用稍微加温的载玻片制备印片时，可印得较多细胞。2.制作淋巴结印片前，应先用滤纸吸去淋巴结切面上的血液、组织液。（二）压片：1.选取微小薄片组织平铺于一张载玻片上，再用另一张载玻片叠加其上并予轻压。2.脑组织质软，易于制作压片；稍硬的组织需切成细碎薄片制作压片。四、涂片的固定（一）用于苏木精-伊红染色和巴氏染色的涂片必须湿固定，即涂片后立即进行固定。乳头溢液涂片和液体标本离心沉淀物涂片，应待涂膜潮干（即周膜稍干而其中央区域未干）时进行固定。用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色的涂片，必须干固定，即待涂片稍干后再进行固定。（二）固定液1.乙醇-冰醋酸液：95%乙醇∶冰醋酸=99∶1。常用。2.乙醇－乙醚液：95%乙醇49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸1ml。较常用。3.甲醇：滴加在干燥涂片上，用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色。4.丙酮：适用于酮类染色。5.Carnoy液：由无水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成，适用于显示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定3～5min后，应移入95%乙醇中继续固定。6.对于液体标本的离心沉淀物、试管拉网获取的小块组织或吸出物中的细小组织块等，固定于4%中性甲醛液中1h，然后制作常规石蜡包埋切片。（三）固定方法1.浸入法：（1）将稍微干燥（不能完全干燥）的涂片直接浸泡于固定液内至少15～30min.（2）因细胞容易脱落，宜以一个盛有固定液的容器只固定一例标本的涂片；一个容器固定多例涂片时，有可能造成的肿瘤细胞交叉污染。（3）必要时可将标本涂在硅化载玻片上，以防脱落。（4）固定液重复使用时，应先用滤纸过滤。(5)95%乙醇固定液多次重复使用时，需测定其浓度比重，乙醇浓度低于90%时应予弃用。2.滴加法：将固定液滴加于平放的干燥涂片上，应避免因固定液挥发造成沉淀。（四）固定后未染色涂片的保存或邮寄：涂片固定15min后取出，立即滴加数滴甘油于涂膜上。对该涂片进行染色前，应先将其置于95%乙醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于细胞病理学涂片检查的是苏木素-伊红（HE）染色和巴氏染色。一些特殊染色、组织化学染色和免疫组织化学染色也用于细胞病理学的涂片检查（参见第4章第一、二节）。（一）苏木素-伊红（HE）染色（参见本章第一节的“六”项）。（二）巴氏（Papanicolaou）染色巴氏染色时，细胞透明度好，细胞结构清晰，色彩丰富而鲜艳，主要用于妇科细胞学涂片、痰涂片和富含鳞状上皮细胞的涂片检查。1.试剂配制(1)Harri苏木素液（参见本章第一节的“六”项）（2）盐酸-乙醇液浓盐酸1ml70%乙醇99ml（3）橙黄G6液橙黄G60.5g蒸馏水5ml无水乙醇95ml磷钨酸0.015g先将橙黄G溶于蒸馏水中，再加入无水乙醇，然后加入磷钨酸。(4)EA36染液①EA36储备液A液：亮绿0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。B液：伊红0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。C液：俾斯麦棕0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。②EA36工作液EA36储备液的A液45mlEA36储备液的B液45mlEA36储备液的C液10ml磷钨酸0.2g碳酸锂饱和水溶液1滴2.染色程序（1）将已经固定的涂片置于80%乙醇中2min。（2）蒸馏水洗2min。（3）苏木素液染核10～12min，自来水洗。（4）盐酸-乙醇液分解约20～30s，至涂片呈淡橙红色。（5）流水冲洗10～15min，蒸馏水洗。（6）依次用80%、95%乙醇脱水，各2min。（7）橙黄G6液染色3～5min。(8)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(9)EA36工作液染色3～5min。(10)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。（11）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：细胞核呈深蓝色，核仁呈红色；不同分化类型的鳞状上皮细胞，其胞浆颜色各异：角化细胞呈粉红色，不全角化细胞呈橙黄色，角化前细胞呈淡蓝或淡绿色；红细胞呈橙红或鲜红色，白细胞的胞浆呈淡蓝绿色；黏液呈淡蓝或粉红色。（三）瑞氏（Wright）染色瑞氏染色一般用于血液涂片，也可用于检查肿瘤细胞。1.试剂配制（1）瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml将瑞氏染料放入研钵内，加入适量甲醇与之混合研磨，使染料逐渐溶解。将溶解的染液倾入另一玻璃瓶内，然后再加入适量甲醇继续研磨；未溶解的染料如此反复多次，直至染料完全溶解、甲醇用完为止。染液避光保存备用。（2）磷酸盐缓冲液无水磷酸氢二钠6.5g磷酸二氢钠4g蒸馏水1000mlpH:6.5~7.02.染色程序(1)涂片自然干燥。（2）滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸缓冲液，轻轻摇荡玻片或用洗耳胶球在玻片上轻轻吹气，使两液体混合均匀，持续10～15min。（4）流水洗去染液。（5）涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：胞核呈紫红色，胞浆呈紫蓝色，黏液呈粉红色或淡蓝色。（四）May-Grünwald-姬姆萨（Giemsa）染色May-Grünwald-吉姆萨染色适用于造血系统的细胞涂片和鉴别恶性淋巴瘤的类型。May-Grünwald原液和姬姆萨原液配制烦琐，可直接购买。1.试剂配制(1)May-Grünwald工作液May-Grünwald原液1份蒸馏水6～10份使用前配制。（2）姬姆萨工作液姬姆萨原液1份蒸馏水6～10份使用前配制。2.染色程序（1）涂片自然干燥，蒸馏水洗1～2min。(2)May-Grünwald工作液染15～30min。（3）自来水冲洗，洗去载玻片上的染液，蒸馏水清洗。（4）姬姆萨工作液染15～30min。（5）自来水冲洗，洗去载玻片上的染液。（6）涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：胞核呈紫红色，胞浆和核仁呈蓝紫色。（五）Rakoff染色Rakoff染色用于阴道细胞学涂片快速测定雌激素水平。1.试剂配制(1)5%淡绿水溶液83ml(2)1%伊红水溶液17ml将两液混合后使用。2.染色程序（1）用细胞刷沿阴道侧壁刷取黏膜鳞状上皮细胞，放入装有1～2ml生理盐水的试管内。（2）在试管内滴入3滴Rakoff染液，用细胞刷在染液中轻摇混合。（3）将1~2滴混合液滴于载玻片上，制成涂片。（4）待涂片干燥后，用中性树胶封片。染色结果：鳞状上皮细胞的嗜酸性和嗜碱性胞浆区分明显。角化前细胞的核呈网状，角化细胞的固缩核呈基本不着色的空泡状。（六）猩红-固绿染色猩红-固绿染色用于显示性染色体。1.试剂配制(1)猩红染液水溶性比布里西猩红1.0g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酒精100ml（2）固绿染液：固绿0.5g磷钼酸0.3g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%乙醇100ml2.染色步骤（1）涂片经95%乙醇固定后，置于70%乙醇中2min。（2）猩红染液中5min。(3)50%乙醇中漂清多余染液。（4）固绿染液中分解2～5h。每小时在显微镜下观察胞浆和网状核膜是否呈现绿色；如果绿色满意，立即取出涂片（一般约需4h）。固锁核呈鲜红色。(5)50%乙醇中5min。（6）依次置于70%、95%和无水乙醇中各2min。（7）置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，各2min。（8）中性树胶封片。染色结果：胞核呈淡绿色；性染色质呈粉红色、V字形或贴着于细胞膜呈三角形。在性染色质周围可见空泡。（七）Fouchet染色Fouchet染色用于显示胆色素。1.染液配制Fouchet染液A液：25%三氯醋酸水溶液B液：10%三氯化铁水溶液A.B液皆小量新鲜配制为宜。使用时，取A、B液各30ml混匀（当天使用）。2.染色步骤（1）涂片经95%酒精固定后，置于蒸馏水中漂洗。(2)Fouchet液中染5min。（3）蒸馏水Ⅰ、Ⅱ中各1min。（4）苦味品红溶液中染5min。(5)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中漂洗。（6）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脱水。（7）二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，中性橡胶封片。3.染色结果：胆色素呈橄榄绿色，胶原纤维呈红色，涂片背景呈黄色。（八）硫酸亚铁染色硫酸亚铁染色用于显示黑色素。1.试剂配制(1)2.5%硫酸亚铁水溶液（2）铁氰化钾醋酸液铁氰化钾1g蒸馏水99ml冰醋酸1ml(3)1%冰醋酸水溶液（4）核固红液[参见第4章第一节的八（三）项（爱先蓝法）]2.染色程序（1）涂片经95%酒精固定后，置于蒸馏水中漂洗1～2min。(2)2.5%硫酸亚铁溶液中1h。（3）蒸馏水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中漂洗，各1min。（4）铁氰化钾醋酸液中30min。(5)1%冰醋酸液中1min。（6）蒸馏水漂洗。（7）核固红液中染1～2min。（8）蒸馏水