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文档简介
细胞学诊断检材的制备技术一、细胞涂片、组织印片和压片的制备(一)涂片质量的基本要求1.将检材涂布于载玻片的右(或左)2/3处,另1/3部位粘贴标签。2.单向涂布检材,避免细胞变形。3.均匀涂布检材,涂片厚薄适当。4.红细胞过多的涂片,可酌情进行溶解红细胞处理。(二)涂片方法1.涂抹法:用棉签或针头将标本单向、均匀地涂抹于载玻片上。2.拉片法:将一滴检材置于一张载玻片上,再用另一张载玻片叠加其上并予轻压,再将该两张载玻片朝反向拉动,从而获得两张涂片。3.推片法:将一滴检液置于载玻片的右端,再用另一张窄边光滑的载玻片作为推片,并以与滴液载玻片成40°夹角、自右向左匀力推动检液,形成涂片。(三)痰涂片的制作1.送检的痰液应是由肺内咳出,最好是清晨空腹时自肺内深咳出的痰液。2.核查无误的收验痰液,应立即制作涂片(通常为2~3张)。3.用细签或无钩镊子挑取痰液置于载玻片上,并左右往复薄涂,随即投入固定液中。4.痰液中呈现下列性状的成分可能含有癌细胞,应注意挑取制作涂片:①血丝;②灰白色痰丝(形如白色细线,微细螺旋状,牵引时可伸长);③透明痰液(可拉成较长细丝)。[及时在细胞学检查申请单上记录痰液性状]5.检查痰液中的肿瘤细胞,一般应连续送检3次。(四)黏膜、皮肤表面刮取(刷取、拉取)物和分泌物的涂片的制作1.阴道排出物、子宫颈刮取物涂片:通常由妇产科医师将已制作、固定后的涂片送交病理科检查。[注意由子宫颈外口上皮移行带刮取细胞涂片]2.支气管镜、胃镜等内腔镜的黏膜刷取物涂片(黏膜刷片):刷片通常由内腔镜医师制作、固定后送交病理科检查。3.食管、胃拉网涂片:由食管拉出的套网气囊适量放气后,将气囊套网在载玻片滚动涂片,尤应将套囊上血丝、灰白色物制作涂片;涂片通常由有关临床医师将已制作、固定后的涂片送交病理科检查。套网中的小块组织可用来制作石蜡包埋切片。4.眼、耳、鼻、咽、口腔、皮肤等处病变(溃疡性病变等)的分泌物涂片。(五)液体涂片的制作液体标本(检材)包括乳头溢液、胸腔积液、腹水、尿液、胃液、脑脊液、穿刺液、冲洗液、灌注液等。除乳头溢液外,其他液体检材一般均应先行离心(2000r/min,10~20min)后,取其沉淀物制作涂片;液体检材也可用细胞涂片离心机(cytospin)直接制作细胞涂片。制作好的涂片应立即固定和染色。[及时在细胞学检查申请单上记录液体标本的性状和数量]液体标本的离心沉淀物较多时,将制作涂片后剩余的沉淀物固定于4%中性甲醛中1h,然后用擦镜纸或绸布将其包裹,制作石蜡包埋切片。1.乳头溢液:直接滴于载玻片上制作涂片。(1)患者乳腺触及肿物时:用手指自肿物远方沿乳腺导管引流方向轻力按模挤压,获取溢液,宜取中段溢液和血性溢液涂片。(2)患者乳腺未触及肿物时:可自乳晕周围向乳腺外周轻力按摩挤压,获取溢液。2.胸水和腹水(1)由患者体内抽取的胸腔积液或腹水应尽快送交病理科验收,检液量以200~500ml为宜。因故(例如远途)延时送达时,需在标本中加入40%的甲醛(加入量为送检胸腔积液、腹水量的1/5),或加入等量的50%乙醇-生理盐水。(2)胸腔积液、腹水的离心:采取容器底部的液体10ml(包括可能存在的沉淀物),移入离心管内进行离心。(3)离心后,倾去全部上清液,将离心管底部含有沉淀物的液体摇匀并用吸管吸出适量,滴注于载玻片上,制作涂片。3.尿液(1)制作方法同胞、腹水。(2)尿液含有胶状物时,应先将其除去。清除方法:用0.5ml/L氢氧化钠调节尿液Ph至6.0;离心后,倾去上清液,再向沉淀物中加入95%乙醇5~10ml/L(固定细胞),静置5min后加入蒸馏水并轻摇(溶去胶状物);再次离心后,取沉淀物制作涂片。检查尿液中的肿瘤细胞,一般应连续送检3次。4.胃液、胃冲洗液:制作方法同胞、腹水。5.脑脊液(1)制作方法同胞、腹水。(2)脑脊液内细胞一般较少,可用微孔滤膜过滤法、沉淀法或纤维捕捉法收集细胞,制作涂片。6.冲洗液、灌洗液、穿刺液涂片的制作:参见上述的胸腔积液、腹水项。二、肿物细针穿刺物涂片的制备(一)实施细则针穿刺术前的准备工作1.实施细则针穿刺术的病理医师应先了解患者临床情况,向患者和/或患者授权人说明实施穿刺术的意义、局限性和其他相关问题等,取得患者和/或患方的知情和理解,并签署由各医院制订的《申请实施细针穿刺术细胞病理学诊断患方知情同意书》。2.合格的手术操作环境。3.必备的适用手术器械和其他相关设施。(二)肿物穿刺术的操作要点:1.确认肿物部位并估计其大小、与皮表距离和质地(实/囊性、硬度等),以指导穿刺的方向、深度和用力程度。2.必须严格实行无菌操作。3.根据肿物大小及其血供情况选择适用型号的穿刺用针头。穿刺用针头的外径为0.6~0.9mm,安置在2ml或10ml的一次性空注射器上。4.针吸法穿刺术操作要点(1)进行穿刺前,先将安装了穿刺用针头的空注射器管芯外拉2cm;然后,用手固定肿物,将安装在空注射器上的穿刺用针头刺入肿物(注射器内无空气)。(2)迅速上下提插注射器管芯10~20次(其间变换针头方向3~4次),遂使肿物不同部位的多余内容吸进入针头和注射器内。(3)将注射器与针头分离(管内负压因而解除);随后,再将该注射器与仍插于肿物内的针头相接,拔出针头,穿刺结束。(4)迅速推动注射器的管芯,尽快地将位于穿刺针头内的少量吸出物排射在2~3张清洁的载玻片上,进行涂片。5.涂片方法:用针头将载玻片上的吸出物轻轻均匀拨开,或用推片法朝一个方向展开(不可双向往返推移)。6.吸出物过少时,可用向离心管内冲洗穿刺针头;再将冲洗液离心,然后取其沉淀物涂片[参见上述一(五)项“液体涂片的制作”]。7.吸出物较多时,可适量50%乙醇-生理盐水液将涂片后注射器和针头内剩余的吸出物冲洗至离心管中,离心后,取其沉淀物制作常规石蜡包埋切片。8.吸出物中含有细小组织块时,应将其制作常规石蜡包埋切片。9.内脏肿物穿刺时,必须在影像学检查的引导下用较长细针进行穿刺。10.穿刺操作完成后,即在细胞病理学检查单上书写穿刺记录。三、组织印片、压片的制备(一)组织印片:1.用锋利刀片剖开刚切取的新鲜肿瘤组织或淋巴结等,然后用清洁载玻片轻压于组织剖面处,将组织表面的细胞成分印在玻片上。用稍微加温的载玻片制备印片时,可印得较多细胞。2.制作淋巴结印片前,应先用滤纸吸去淋巴结切面上的血液、组织液。(二)压片:1.选取微小薄片组织平铺于一张载玻片上,再用另一张载玻片叠加其上并予轻压。2.脑组织质软,易于制作压片;稍硬的组织需切成细碎薄片制作压片。四、涂片的固定(一)用于苏木精-伊红染色和巴氏染色的涂片必须湿固定,即涂片后立即进行固定。乳头溢液涂片和液体标本离心沉淀物涂片,应待涂膜潮干(即周膜稍干而其中央区域未干)时进行固定。用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色的涂片,必须干固定,即待涂片稍干后再进行固定。(二)固定液1.乙醇-冰醋酸液:95%乙醇∶冰醋酸=99∶1。常用。2.乙醇-乙醚液:95%乙醇49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸1ml。较常用。3.甲醇:滴加在干燥涂片上,用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色。4.丙酮:适用于酮类染色。5.Carnoy液:由无水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成,适用于显示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定3~5min后,应移入95%乙醇中继续固定。6.对于液体标本的离心沉淀物、试管拉网获取的小块组织或吸出物中的细小组织块等,固定于4%中性甲醛液中1h,然后制作常规石蜡包埋切片。(三)固定方法1.浸入法:(1)将稍微干燥(不能完全干燥)的涂片直接浸泡于固定液内至少15~30min.(2)因细胞容易脱落,宜以一个盛有固定液的容器只固定一例标本的涂片;一个容器固定多例涂片时,有可能造成的肿瘤细胞交叉污染。(3)必要时可将标本涂在硅化载玻片上,以防脱落。(4)固定液重复使用时,应先用滤纸过滤。(5)95%乙醇固定液多次重复使用时,需测定其浓度比重,乙醇浓度低于90%时应予弃用。2.滴加法:将固定液滴加于平放的干燥涂片上,应避免因固定液挥发造成沉淀。(四)固定后未染色涂片的保存或邮寄:涂片固定15min后取出,立即滴加数滴甘油于涂膜上。对该涂片进行染色前,应先将其置于95%乙醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于细胞病理学涂片检查的是苏木素-伊红(HE)染色和巴氏染色。一些特殊染色、组织化学染色和免疫组织化学染色也用于细胞病理学的涂片检查(参见第4章第一、二节)。(一)苏木素-伊红(HE)染色(参见本章第一节的“六”项)。(二)巴氏(Papanicolaou)染色巴氏染色时,细胞透明度好,细胞结构清晰,色彩丰富而鲜艳,主要用于妇科细胞学涂片、痰涂片和富含鳞状上皮细胞的涂片检查。1.试剂配制(1)Harri苏木素液(参见本章第一节的“六”项)(2)盐酸-乙醇液浓盐酸1ml70%乙醇99ml(3)橙黄G6液橙黄G60.5g蒸馏水5ml无水乙醇95ml磷钨酸0.015g先将橙黄G溶于蒸馏水中,再加入无水乙醇,然后加入磷钨酸。(4)EA36染液①EA36储备液A液:亮绿0.5g,溶于5ml蒸馏水中,溶解后加入无水乙醇至100ml。B液:伊红0.5g,溶于5ml蒸馏水中,溶解后加入无水乙醇至100ml。C液:俾斯麦棕0.5g,溶于5ml蒸馏水中,溶解后加入无水乙醇至100ml。②EA36工作液EA36储备液的A液45mlEA36储备液的B液45mlEA36储备液的C液10ml磷钨酸0.2g碳酸锂饱和水溶液1滴2.染色程序(1)将已经固定的涂片置于80%乙醇中2min。(2)蒸馏水洗2min。(3)苏木素液染核10~12min,自来水洗。(4)盐酸-乙醇液分解约20~30s,至涂片呈淡橙红色。(5)流水冲洗10~15min,蒸馏水洗。(6)依次用80%、95%乙醇脱水,各2min。(7)橙黄G6液染色3~5min。(8)95%乙醇洗2~3次,洗去多余染液。(9)EA36工作液染色3~5min。(10)95%乙醇洗2~3次,洗去多余染液。(11)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。3.染色结果:细胞核呈深蓝色,核仁呈红色;不同分化类型的鳞状上皮细胞,其胞浆颜色各异:角化细胞呈粉红色,不全角化细胞呈橙黄色,角化前细胞呈淡蓝或淡绿色;红细胞呈橙红或鲜红色,白细胞的胞浆呈淡蓝绿色;黏液呈淡蓝或粉红色。(三)瑞氏(Wright)染色瑞氏染色一般用于血液涂片,也可用于检查肿瘤细胞。1.试剂配制(1)瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml将瑞氏染料放入研钵内,加入适量甲醇与之混合研磨,使染料逐渐溶解。将溶解的染液倾入另一玻璃瓶内,然后再加入适量甲醇继续研磨;未溶解的染料如此反复多次,直至染料完全溶解、甲醇用完为止。染液避光保存备用。(2)磷酸盐缓冲液无水磷酸氢二钠6.5g磷酸二氢钠4g蒸馏水1000mlpH:6.5~7.02.染色程序(1)涂片自然干燥。(2)滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸缓冲液,轻轻摇荡玻片或用洗耳胶球在玻片上轻轻吹气,使两液体混合均匀,持续10~15min。(4)流水洗去染液。(5)涂片风干后,二甲苯透明,中性树胶封片。3.染色结果:胞核呈紫红色,胞浆呈紫蓝色,黏液呈粉红色或淡蓝色。(四)May-Grünwald-姬姆萨(Giemsa)染色May-Grünwald-吉姆萨染色适用于造血系统的细胞涂片和鉴别恶性淋巴瘤的类型。May-Grünwald原液和姬姆萨原液配制烦琐,可直接购买。1.试剂配制(1)May-Grünwald工作液May-Grünwald原液1份蒸馏水6~10份使用前配制。(2)姬姆萨工作液姬姆萨原液1份蒸馏水6~10份使用前配制。2.染色程序(1)涂片自然干燥,蒸馏水洗1~2min。(2)May-Grünwald工作液染15~30min。(3)自来水冲洗,洗去载玻片上的染液,蒸馏水清洗。(4)姬姆萨工作液染15~30min。(5)自来水冲洗,洗去载玻片上的染液。(6)涂片风干后,二甲苯透明,中性树胶封片。3.染色结果:胞核呈紫红色,胞浆和核仁呈蓝紫色。(五)Rakoff染色Rakoff染色用于阴道细胞学涂片快速测定雌激素水平。1.试剂配制(1)5%淡绿水溶液83ml(2)1%伊红水溶液17ml将两液混合后使用。2.染色程序(1)用细胞刷沿阴道侧壁刷取黏膜鳞状上皮细胞,放入装有1~2ml生理盐水的试管内。(2)在试管内滴入3滴Rakoff染液,用细胞刷在染液中轻摇混合。(3)将1~2滴混合液滴于载玻片上,制成涂片。(4)待涂片干燥后,用中性树胶封片。染色结果:鳞状上皮细胞的嗜酸性和嗜碱性胞浆区分明显。角化前细胞的核呈网状,角化细胞的固缩核呈基本不着色的空泡状。(六)猩红-固绿染色猩红-固绿染色用于显示性染色体。1.试剂配制(1)猩红染液水溶性比布里西猩红1.0g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酒精100ml(2)固绿染液:固绿0.5g磷钼酸0.3g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%乙醇100ml2.染色步骤(1)涂片经95%乙醇固定后,置于70%乙醇中2min。(2)猩红染液中5min。(3)50%乙醇中漂清多余染液。(4)固绿染液中分解2~5h。每小时在显微镜下观察胞浆和网状核膜是否呈现绿色;如果绿色满意,立即取出涂片(一般约需4h)。固锁核呈鲜红色。(5)50%乙醇中5min。(6)依次置于70%、95%和无水乙醇中各2min。(7)置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明,各2min。(8)中性树胶封片。染色结果:胞核呈淡绿色;性染色质呈粉红色、V字形或贴着于细胞膜呈三角形。在性染色质周围可见空泡。(七)Fouchet染色Fouchet染色用于显示胆色素。1.染液配制Fouchet染液A液:25%三氯醋酸水溶液B液:10%三氯化铁水溶液A.B液皆小量新鲜配制为宜。使用时,取A、B液各30ml混匀(当天使用)。2.染色步骤(1)涂片经95%酒精固定后,置于蒸馏水中漂洗。(2)Fouchet液中染5min。(3)蒸馏水Ⅰ、Ⅱ中各1min。(4)苦味品红溶液中染5min。(5)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中漂洗。(6)无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脱水。(7)二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明,中性橡胶封片。3.染色结果:胆色素呈橄榄绿色,胶原纤维呈红色,涂片背景呈黄色。(八)硫酸亚铁染色硫酸亚铁染色用于显示黑色素。1.试剂配制(1)2.5%硫酸亚铁水溶液(2)铁氰化钾醋酸液铁氰化钾1g蒸馏水99ml冰醋酸1ml(3)1%冰醋酸水溶液(4)核固红液[参见第4章第一节的八(三)项(爱先蓝法)]2.染色程序(1)涂片经95%酒精固定后,置于蒸馏水中漂洗1~2min。(2)2.5%硫酸亚铁溶液中1h。(3)蒸馏水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中漂洗,各1min。(4)铁氰化钾醋酸液中30min。(5)1%冰醋酸液中1min。(6)蒸馏水漂洗。(7)核固红液中染1~2min。(8)蒸馏水
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