广西《厚藤质量控制技术规程》编制说明

广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据《关于下达2016年第六批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知》（桂质监函〔2016〕324号）文件精神，由广西中医药大学提出，由广西中医药大学起草广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》（项目编号为2016-06065）。二、项目背景及目的意义厚藤Ipomoeapes-caprae(L.)Sweet为旋花科(Convolvulaceae)番薯属(Ipomoea)多年生匍匐蔓生草本植物，广布于全球热带及亚热带沿海地区，在我国广泛分布于浙江、台湾、福建、广东、广西、海南等热带和亚热带海滩上。厚藤为广西特色海洋中药，同时还具有多种实用价值，可用于食品、饲料等行业，市场远景广阔。因此，为了更好地保护和应用这一植物资源，提高其质量和创汇能力，促进其推广应用，我们提出了制定《厚藤质量控制技术规程》的建议。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组本项目实行在项目主持人负责下的小组负责制，各个实施单位指定研究小组组长和成员后，对项目任务进行分解和分配，明确各小组的责任、项目实施计划，对小组成员的职责和进度进行细化，确保项目高效如期进行。在标准项目下达后及时成立了以广西中医药大学侯小涛教授主持，邓家刚、郝二伟、杜正彩、秦健峰、冯小慧为参与成员的标准编制小组，及时部署了标准编制的工作方案和时间进度表。在标准起草前，研究了厚藤的相关文献资料，并对课题研究成果进行了全面整理和总结讨论。在编制过程中，还深入广西各大主要产区广泛资源调查，同时咨询了相关权威专家，力争编制工作过程科学、严谨，方法、技术路线正确。（二）收集整理文献资料以及前期工作基础迄今为止，标准起草小组成员对厚藤相关研究进行了大量的文献收集以及进行了一系列药效筛选及化学成分的初步研究。厚藤不仅是具有绿化、防风固沙、抵御自然灾害、恢复生态等功能的海滩景观植物，也是中国南方沿海的民间常用海洋中药、京族习用植物药。《中华海洋本草》、《中华本草》、《广西药用植物名录》等多部著作中均有该植物药用的记载，中医认为其味辛、苦，性微寒，归肺、肝、胃、大肠经，具祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效，民间应用于治疗腰肌劳损、风湿关节痛、腰腿痛及疮疖、痔疮、海蜇引起的皮炎。厚藤在其他多个国家民间医学领域均有悠久的应用历史，如：澳大利亚土著人用于治疗伤口、虫毒引起的皮肤炎症、淋巴结结核、高血压、偏头痛，墨西哥民间用于治疗肾炎，泰国民间用于治疗水母毒素引起的炎症，巴西民间用于治疗疝气、排尿障碍、淋病，巴基斯坦也将其作为代茶饮。现代研究表明，厚藤具有抗肿瘤、抗菌、抗炎镇痛、抗胶原酶、抗氧化、免疫调节等多种药理活性。厚藤具有悠久的传统应用历史和明确的药理活性，且资源丰富易得，但至今未有质量标准，因此，本研究以海洋中药厚藤为对象，对其质量标准进行研究：建立了厚藤的薄层色谱鉴别法；测定了厚藤的水分、总灰分、浸出物的含量；建立了HPLC法测定六个成分的方法；采用以绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的总含量为考察指标，通过单因素试验及响应面试验优化提取工艺；结合化学计量法建立HPLC及UPLC指纹图谱，生成指纹图谱共有模式，本课题可为该海洋中药的临床应用、质量控制和产品开发等提供参考。（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料以及前期研究基础进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准该部分的主体内容确定为范围、规范性引用文件、术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存。（四）调研及形成征求意见稿在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关厚藤质量标准的要求，并结合广西厚藤质量控制实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》（草案）。2016年7月，广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》获自治区质监局批准立项。2016年8月-12月，标准编制工作组组织部门有关专家征求广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》（草案）意见。2017年1月-2018年12月，标准编制工作组按照专家意见进行标准的完善。2019年1月-12月，标准编制工作组在南宁市组织全区相关领域专家对广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》进行征求意见。经过多次讨论、研究，最终形成广西地方标准《厚藤质量控制技术规程》（征求意见稿）和编制说明。四、标准主要章节内容及确定依据（一）标准涉及的技术原理及依据采用现代分析技术对厚藤的感官指标、理化指标进行分析测定，对厚藤进行质量控制是本标准制定的出发点。水分的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832中第二法的规定测定。总灰分的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2303的规定测定。浸出物的测定：按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2201的规定测定，用50%乙醇溶液作溶剂。咖啡酸的含量测定：采用高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512）测定。（二）、标准涉及技术的具体实施方案按照广西壮族自治区市场监督管理局关于标准编制工作的要求，标准起草小组成员于项目实施期间，深入广西防城港市、广西北海市、广西钦州市、海南陵水黎族自治县、海南海口市秀英区等地区开展资源调查、样品采集。厚藤采集于广西及海南，总计10批，经广西中医药大学李永华教授鉴定为旋花科植物厚藤Ipomoeapes-caprae（L.）Sweet的干燥茎叶，新鲜药材置烘箱中55℃烘干，粉碎，药材粉末过55目筛备用，批号如表1所示；表1不同产地厚藤的样品来源信息编号产地采收时间IP-1广西城港市防城区2016/03/26IP-2广西防城港市防城区江山半岛—三块石2016/06/24IP-3广西防城港市防城区江山半岛—脯鱼湾2016/06/24IP-4广西防城港市防城区江山半岛—白浪滩2016/06/24IP-5广西防城港市防城区江山半岛—白沙湾2016/06/24IP-6广西防城港市防城区-北仑河口红树林自然保护区2016/07/10IP-7广西北海市合浦县白沙镇独山村2016/10/15IP-8海南陵水黎族自治县陵水英州镇清水湾2017/02/17IP-9广西钦州市三娘湾2017/06/12IP-10海南海口市秀英区2017/07/151.水分含量测定参照2015版《中国药典》第四部（通则0832)水分测定法第二法烘干法，测定10批不同产地厚藤的水分，根据公式：水分含量W5%=（W2—W4）/W，计算供试品中含水分含量，结果如表2所示，10批厚藤药材的水分含量的最大值（10.64%）上浮10%即水分含量上限，所以，暂定厚藤的水分含量不得过12%。表210批厚藤药材的水分含量（烘干法）结果（n=2）药材编号样品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ样品重瓶重W2/ɡ干燥5h后总重W3/ɡ干燥1h后总重W4/ɡ水分含W5量/%平均值/%1-12.004069.604371.608371.400271.394910.6510.521-22.000367.367769.368069.163369.160210.392-12.000367.365469.365769.176769.16989.799.832-22.000566.645168.645668.453268.44839.863-12.000566.773568.774068.609368.60388.518.543-22.000868.194170.194970.026870.02358.574-12.000965.655167.656067.455467.453410.1310.234-22.000566.601468.601968.401868.395310.335-12.000268.483470.483670.285770.282010.0810.145-22.000966.016668.017567.817267.813510.206-12.000067.564469.564469.362669.352410.6010.426-22.000666.785868.786468.586468.581610.247-12.000167.901569.901669.695769.690710.5410.557-22.000268.267370.267570.060770.056310.568-12.000667.698669.699269.493169.485510.6810.648-22.000866.644068.644868.442368.432710.609-12.000068.064070.064069.875369.86679.869.909-22.000867.984869.985669.795769.78699.9310-12.000367.571469.571769.411869.40838.178.1910-22.000268.098270.098469.937769.93428.212.总灰分的测定参照2015版《中国药典》第四部总灰分测定法（通则2302），测定10批不同产地厚藤的总灰分，根据公式：总灰分W5%=（W4—W1）/W，计算供试品中总灰分的百分含量，结果如表3所示，根据10批厚藤的总灰分含量最大值（14.46%）上浮10%即总灰分上限，所以，暂定厚藤的总灰分含量不得过16%。表310批厚藤药材的总灰分含量结果（n=3）药材编号样品重W/ɡ恒重后空瓶重W1/ɡ样品重+瓶重W2/ɡ灰化5h后总重W3/ɡ灰化1h后总重W4/ɡ总灰分W5/%平均值/%RSD/%1-13.002338.950341.952639.196339.19678.218.120.971-23.001040.259043.260040.499040.50068.051-33.001940.123943.125846.160540.36758.112-13.000939.660942.661839.876939.87697.207.160.942-23.000939.489042.489939.705539.70497.192-33.001839.596642.598439.813239.80917.083-13.000239.854542.854740.162540.161110.2210.140.753-23.002239.914242.916440.218240.216510.073-33.001740.228943.230640.534440.532810.124-13.001838.704241.706038.979438.97749.109.070.334-23.001840.554243.556040.827840.82569.044-33.000939.266142.267039.540539.53849.075-13.001538.686741.688239.018539.019511.0911.090.155-23.001239.763842.765040.096940.096111.075-33.000339.711242.711540.045340.044411.116-13.000738.952641.953339.382939.382714.3314.460.746-23.001540.258343.259840.693740.693714.516-33.001340.123343.124640.559240.559414.537-13.001839.657442.659239.992639.992911.1811.150.507-23.001239.480942.482139.816539.816711.197-33.000739.585942.586639.919639.918611.098-13.000739.855442.856140.107340.10708.388.370.188-23.000639.91542.915640.165740.16578.358-33.001140.230543.231640.481040.48178.379-13.001838.704641.706439.041439.038611.1311.060.869-23.000940.555343.556240.891340.888611.119-33.001439.266542.267939.598139.595210.9510-13.000438.687541.687938.966938.96469.249.190.4310-23.001439.764242.765640.042140.03959.1710-33.001239.7142.711239.987639.98509.163.浸出物的测定参照2015版《中国药典》第四部浸出物测定法（通则2201）项下水溶性浸出物测定法，除另有规定外，以一定浓度的乙醇代替水为溶剂。本实验对50%、70%、95%乙醇浓度及冷浸法、热浸法进行了考察，结果如表4。结果表明，50%乙醇的浸出物均比其他浓度要高，后续试验将50%乙醇作为溶剂。10批厚藤的热浸法醇溶性浸出物含量均比冷浸法高，将最低测定值下浮10%作为含量下限值，综上，厚藤药材适宜采用50%乙醇进行醇溶性进行醇溶性浸出物检查，规定厚藤的冷浸法醇溶性浸出物不得少于15%，热浸法醇溶性浸出物不得少于20%。表4厚藤药材醇溶性浸出物（热浸法）的乙醇浓度考察结果（n=2）药材编号乙醇浓度/%样品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿总重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%2-150%2.000277.486877.71030.447122.3522.792-22.000580.054180.28640.464523.222-370%2.000577.736377.91850.364418.2218.472-42.000177.341777.52900.374518.722-595%2.000180.274880.38610.222811.1411.092-62.000377.135477.24580.220711.03表510批厚藤药材醇溶性浸出物（冷浸法）的含量结果（n=3）药材编号样品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿总重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-14.000491.991792.12180.650116.2516.370.641-24.000480.052880.18430.657816.441-34.0008102.6985102.82990.657016.422-14.000292.723992.86230.692017.3017.360.462-24.0001102.3960102.53560.698117.452-34.000271.265871.40460.693817.343-14.000677.343777.49340.748218.7018.910.993-24.000880.275880.42830.762919.073-34.000777.137077.28860.758118.954-14.000877.500977.71841.087427.1828.052.734-24.000292.388492.61501.133228.334-34.000477.737577.96661.145428.635-14.000658.013858.20740.968224.2023.941.365-24.000956.549056.74130.961824.045-34.000551.887552.07610.943023.576-14.000658.013958.19990.929923.2423.390.576-24.000356.548056.73550.937823.446-34.000751.884952.07290.940123.507-14.000758.013358.20050.935823.3923.320.257-24.000556.547156.73350.932023.307-34.000151.883652.06990.931323.288-14.000977.486877.67500.940723.5123.650.538-24.000680.050980.24040.947523.698-34.000777.735977.92600.950523.769-14.000377.343677.51440.854321.3521.570.909-24.000480.275780.44870.864621.619-34.000677.136877.31070.869621.7410-14.000158.014958.22541.052626.3126.320.3110-24.000356.549156.76031.056126.4010-34.000451.885152.09501.049526.23表610批厚藤药材醇溶性浸出物(热浸法)的含量结果（n=3）药材编号样品重W/ɡ恒重后空皿重W1/ɡ干燥后皿总重W2/ɡ醇溶性浸出物重量/g醇溶性浸出物含量/%平均值/%RSD/%1-12.000891.992392.21690.449022.443022.771.451-22.000580.052680.28020.455322.75831-32.0005102.6976102.92870.462223.10422-12.000692.723192.96530.484424.211724.301.032-22.0008102.3943102.64030.491924.58422-32.000877.136677.37780.482424.10843-12.000377.487077.742060.510125.499225.622.173-22.000480.051680.313860.524526.22183-32.000077.737277.988440.502625.12904-12.000477.342477.67270.660633.021432.672.184-22.000680.275180.60640.662833.12914-32.000571.265771.58430.637131.84705-12.000977.341277.641530.600730.020530.071.105-22.000380.274580.572170.595429.76655-32.000877.136477.440750.608730.42186-12.000277.340777.61700.552527.623228.212.226-22.000280.274880.55610.562628.12826-32.000971.264771.55360.577728.87007-12.000791.990192.25400.527826.37887-22.000680.052580.31100.517025.842226.111.037-32.0005102.6963102.95730.522026.09558-12.000792.723993.00280.557927.884228.531.968-22.0003102.4030102.69120.576328.81078-32.000477.136377.42530.578028.89429-12.000591.992792.25280.520226.003526.070.809-22.000780.052480.31550.526326.30389-32.0002102.6989102.95790.518125.900410-12.000392.724093.021120.594329.708529.551.0510-22.0008102.3959102.69350.595229.749110-32.000471.265771.557640.583929.19124.响应面法优化厚藤中6种成分的提取工艺及含量测定响应面法(ResponseSurfaceMethod，RSM)，通过对多因素的多个水平进行连续分析，利用回归方程拟合出考核指标与多个因素水平间的函数关系，并以三维曲线图的形式展示。试验者可通过关系系数的显著性检验分析、等高线图及三维曲线图直观分析，判断模型的科学性，通过软件DesignExpert8.0.6计算得到最佳提取工艺。中药提取中影响因素的变化通常为非线性的，响应面法适用于非线性函数关系的因素的优化，所以，响应面法具有很好的适用性；其次，较其他优化方法，响应面法的试验点具有更好的连续分析性，提供更多的函数数据，因此在工农业、医药食品及生命科学领域均有广泛应用。绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C均是厚藤中的活性成分，具有显著的胶原酶抑制剂活性，可能对人体胚胎发育、伤口愈合、防止皮肤老化及抑制肿瘤发生等多种重要生理过程起重要作用。本研究将以上六种成分的含量为考核指标，采用响应面优化法设计试验，对厚藤药材的指标成分的提取工艺进行优化，并测定不同产地及不同采集时间总计20批厚藤中6种成分的含量。4.1色谱条件：色谱柱：AnglientHC-C18（2）色谱柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1％磷酸水溶液（B）；流速：1.0mL/min；柱温：30±5℃；进样量：5µL；洗脱梯度：0~10min，7%~8%A；10~20min，8%~12%A；20~30min，12%~16%A；30~40min，16%~17%A；40~50min，17%~19%A；50~65min，19%~24%A；65~67min，24%~95%A；67~70min，95~95%A。检测波长：0~15min，λ=325nm；15~55min，λ=353nm；55min~70min，λ=325nm；进样量：5µL。绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对照品及厚藤样品色谱图见图1、2。图1混合对照品HPLC图峰S1：绿原酸峰S2：咖啡酸峰S3：异槲皮苷峰S4：异绿原酸B峰S5：异绿原酸A峰S6：异绿原酸C图2样品HPLC图峰1：绿原酸峰2：咖啡酸峰3：异槲皮苷峰4：异绿原酸B峰5：异绿原酸A峰6：异绿原酸C4.2单因素优化试验以绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的总含量为考察指标，考察提取方法、提取溶剂、溶剂浓度、提取时间、提取次数、料液比、提取温度等对厚藤中成分提取率的影响。4.2.1提取溶剂及方法的考察精密称定厚藤药材粉末（IP-5）约1ɡ，共计两组8份，两组分别以75%甲醇、75%乙醇为提取溶剂，加入60mL，平行做2份，每组内分别采用85℃水浴回流、超声法，提取3次，每次2h，抽滤，合并滤液，将滤液转移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少许提取溶剂洗出，转移并定容于25mL容量瓶，超声30min，摇匀，吸取2mL过0.22µm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。按照“2.1”项下色谱条件进行液相分析，记录色谱峰峰面积，计算含量，比较不同提取方法及溶剂的提取率，结果如图3，其中乙醇作为提取溶剂、以加热回流为提取方法的提取率最高，因此采用乙醇回流提取法。图3不同提取方法及溶剂对提取率的影响4.2.2溶剂浓度的考察精密称定厚藤药材粉末（IP-5）约1ɡ，共计10份，分别以50%、60%、70%、80%、90%乙醇为提取溶剂，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次2h，抽滤，合并滤液，将滤液转移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少许提取溶剂洗出，转移并定容于25mL容量瓶，超声30min，摇匀，吸取2mL过0.22µm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。按照“2.1”项下色谱条件进行液相分析，记录色谱峰峰面积，计算含量，比较不同浓度乙醇的提取率。图4不同乙醇浓度对厚藤酚酸类成分提取率的影响结果如图4，当乙醇浓度小于60%时，提取率随着乙醇浓度的增加而增加，当乙醇浓度大于60%时，提取率随着乙醇浓度的增加而减少，可能由于乙醇浓度越大，提取出的非酚酸类杂质所占比重越大，酚酸类成分相对减少。所以，在单因素试验后续，乙醇浓度定为60%，响应面试验乙醇浓度的中心范围为50%~90%。4.2.3提取时间的考察精密称定厚藤药材粉末（IP-5）约1ɡ，共计两组10份，以60%乙醇为提取溶剂，加入60mL，平行做2份，采用85℃水浴回流提取3次，每次分别提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，抽滤，合并滤液，将滤液转移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少许提取溶剂洗出，转移并定容于25mL容量瓶，超声30min，摇匀，吸取2mL过0.22µm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。按照“2.1”项下色谱条件进行液相分析，记录色谱峰峰面积，计算含量，比较不同提取时间的提取率。图5不同提取时间对厚藤酚酸类成分提取率的影响结果如图5所示，当提取时间大于1.5h时，提取率趋于稳定，可能是由于提取1.5h时，厚藤植物细胞中的酚酸类成分已经释放完全，并达到溶解平衡，再延长时间对提取率的影响不大。所以，在单因素试验后续提取时间定为1.5h，响应面试验提取时间的中心范围为1h~2h。4.2.4提取次数的考察精密称定厚藤药材粉末（IP-5）约1ɡ，共计五组10份，以60%乙醇为提取溶剂，加入60mL，每组采用85℃水浴回流提取1次、2次、3次、4次、5次，每次分别提取1.5h，抽滤，合并滤液，将滤液转移至250mL璇蒸瓶，旋干，吸取少许提取溶剂洗出，转移并定容于25mL容量瓶，超声30min，摇匀，吸取2mL过0.22µm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。按照“2.1”项下色谱条件进行液相分析，记录色谱峰峰面积，计算含量，比较