计算机辅助药物设计

计算机辅助药物设计

药物的创制过程主要存在两个瓶颈：一个是疾病相关的靶标生物大分子的确定及验证；另外一个是具有生物活性的小分子药物的设计和发现。

第二节生物信息学在靶标确定中的应用一、抗菌或抗病毒靶标的筛选F．Spaltmann等提出判断一个基因是否适合作为抗菌靶标，必须考虑基因的以下一些性质：

①基因对病菌的存活或感染是否重要；②相同或相似的基因在其他真菌以及人体中的分布情况；③可用以发展高通量筛选的生物化学或功能信息。

二、其它候选药物作用靶标的发现1、新基因的预测与功能研究？？根据DNA序列预测新的ORF利用EST数据库2、生物芯片技术

生物芯片能够用于疾病组织的转录表达的整体分析，一般是通过固定在玻璃片上的克隆DNA或合成的寡聚核苷酸序列与特定细胞或病变细胞的全部cDNA杂交，以确定细胞中所有的基因的序列。通过比较病变组织与正常组织的基因组信息，可以确定疾病相关的靶标。

3、蛋白质组（proteome）学方法另一种很有希望用于寻找靶标及先导化合物的方法是蛋白质组学。蛋白质组学的目的是从整体上研究正常细胞的蛋白质以及病变组织细胞的蛋白质的差异。蛋白质组学利用二维凝胶分离病变组织以及正常组织的蛋白质，测定分离的蛋白质，并对两种组织的蛋白质图进行定性的和定量的比较。因此，蛋白质组信息既是定性的(能够确定哪些蛋白质是不同的)，又是定量的（可以确定同种蛋白质的表达量的差异)。

4、结构生物学方法

由于近几年在蛋白质工程，结晶学和光谱学方面的进展，测定蛋白质结构的速度越来越快。在已知的结构中发现与新测定的生物大分子相似结构的概率也增加了；另外，在无序列相似性的情况下，新发展的算法可以将蛋白质与所有已知结构进行结构比较。序列数据库搜寻和结构数据库搜寻是生物学家研究生物大分子功能的重要手段。

例如，人类肥胖基因(老鼠的肥胖基因的突变导致肥胖或糖尿病)与所有已知的基因、蛋白质都没有序列相似性，然而，对其序列进行核心模板三维数据库搜寻，以确定肥胖蛋白质是否会采取与已知蛋白质类似的折叠方式时(即所谓穿针引线法，threading)，发现肥胖基因表现出明显的与螺旋细胞素家族的结构相似性。因此，研究者认为肥胖基因的产物(1eptin)通过JAK-STAT途径来调节核转录，这个推断后来得到了实验的证实。

三、靶标有效性的验证仅仅确定疾病特异蛋白并不足以开展药物筛选工作，还必须确定蛋白质功能并确证蛋白质确实对疾病过程起关键作用。提出一个候选药物作用靶标通常并不是很困难的事情，目前主要的瓶颈是验证靶标的有效性。错误的结论可能使以后的所有工作努力付之东流。1、基因组学方法针对特定基因的“敲除(knockout)”技术或转基因动物模型是最成熟的验证靶标有效性的方法。基因组学方法的一个缺点是比较慢，培养一个基因“敲除”动物并对其进行评价一般要12—18个月。另外，“敲除”动物可能在胚胎期间就死亡，或者根本就什么都没有，这样的结果无法对药物的研究提供什么有益的信息。

2．蛋白质组学方法蛋白质组学很适合用于确定靶标蛋白质在信号传导路径中所起的作用。，可以获得信号分子的异构化的重要信息(例如糖基化或磷酸化)，因此可以了解在疾病过程中靶标蛋白质发生了那些变化。3、核糖酶方法核糖酶(ribozyme)是具有催化活性的RNA，能够与mRNA杂交并切断mRNA。利用长度大概200个核苷酸的RNA就能设计用以清除细胞中特定mRNA的核糖酶。最简单的核糖酶称为锤头核糖酶(hammerheadribozyme)，锤头核糖酶包括催化核心和“杂交臂”两个部分。催化核心部分具有保守的碱基序列，能够切断RNA。“杂交臂”部分通过互补碱基配对将核糖酶固定在对应的靶标RNA上。Juhl等利用一个由四环素调节的启动子控制几种锤头核糖酶的表达，使得细胞中的Her-2／neumRNA和蛋白质被清除达90％以上。利用这种调节表达系统可以很方便地调节肿瘤实验动物中Her-2／neu的表达。实验揭示了肿瘤在形成过程的不同阶段的耐受性，并确证Her-2／neu是一个决定子宫癌生长速度的成分。

4、免疫化学方法直接针对脊椎动物细胞外大分子抗原识别部位的单克隆或多克隆抗体可用以研究相应大分子的功能，例如，与细胞表面受体结合的抗体能够改变或阻止受体及其同源配体之间的相互作用。细胞内部的大分子现在可以通过细胞内抗体(intracellularantibody，亦即intrabody)来与之发生免疫化学中和。细胞内抗体是单链抗体(scFv)，它由一条重链和一条轻链通过重组的方法得到。利用细胞内抗体，研究人员可以研究病变细胞质和核中的决定因素。对细胞内靶标分子的直接中和方法特别适合研究那些半衰期长的蛋白质，而核糖酶不适合研究这一类蛋白质。

Curiel等利用细胞内抗体研究了乳腺癌细胞凋亡的决定因素。编码erbB-2细胞内单链抗体的基因可以减少细胞表面erbB-2的水平。人胸腺癌和子宫癌细胞株中由erbB-2细胞内单链抗体诱导的细胞凋亡随细胞的表现型不同而有所差异。细胞内抗体实验和核糖酶实验同时表明erb家族成员具有导致癌症的潜在可能，但细胞内抗体实验表明erbB-2在细胞质中的C端结构域对于细胞凋亡是必不可少的。

第三节计算机辅助药物设计

一、合理药物设计的一般过程合理药物设计（rationaldrugdesign）或基于结构的药物设计（structure-baseddrugdesign)就是基于对疾病过程的分子病理生理学的理解，根据靶点的分子结构，并参考效应子的化学结构特征设计出针对该疾病的药物分子，从而引导设计走向合理化。由此设计出的药物往往活性强，作用专一，副作用较低，故称为合理药物设计。合理药物设计离不开计算机，因此也可称为计算机辅助药物设计。计算机辅助药物设计从理论上避免以前研究中一定程度的盲目性，大大加快了研制新药的速度，节省了开发新药工作的人力、物力和财力。如比利时的杨森公司大规模地以计算机辅助进行新药设计，使成功率从以往的万分之一提高到三千分之一。二、计算机辅助药物设计的方法直接药物设计基于靶点结构直接药物设计基于靶点结构的三维结构搜寻模板定位法全新药物设计原子生长法全新药物设计分子碎片法全新药物设计间接药物设计基于药效基团的三维结构搜寻药效基团模型法（一）、直接药物设计这类方法以药物作用的对象——靶标生物大分子的三维结构为基础，研究小分子与受体的相互作用，设计出从空间形状和化学性质两方面都能很好地与靶标分子“结合口袋”相匹配的药物分子。这种方法就像根据“锁”的形状来配“钥匙”一样；因此被称为直接药物设计方法。随着细胞生物学、分子生物学和结构生物学的发展，越来越多的药物作用靶标分子(蛋白质、核酸、酶、离子通道……)被分离、鉴定，其三维结构被阐明，为直接药物设计方法的应用提供了有利的条件。进入20世纪90年代以来，直接药物设计已逐渐成为药物设计研究的主要方法。

1、基于靶点结构直接药物设计根据靶点结构对已知活性物进行修饰，提高其活性，例如：MvonItzstein等人应用唾液酸酶晶体结构设计抗病毒药物。唾液酸酶在微生物的感染和传播中起重要作用，其抑制剂的研究是抗病毒尤其是抗流感病毒研究的新领域。早期发现2-去氧-2,3-双去氢-D-N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac2en）对唾液酸酶有抑制作用，但在动物模型中效果不佳。根据唾液酸酶的晶体结构及其与酶抑制剂Neu5Ac2en的相互作用，发现酶结构上与抑制剂作用部位附近有带负电基团，如将抑制剂4-羟基用氨基取代，则结合作用会增强，因为氨基与酶Glu119羧基侧链形成盐桥。如果4-羟基为胍基取代，则能与Glu119和Glu227相互作用，显示出更强的亲和性。抑制活性测定表明4-氨基和4-胍基取代Neu5Ac2en，比其母体Neu5Ac2en分别提高20倍和5000倍，后者已进入临床，有望成为一种新的抗病毒药物。2、基于靶点结构的三维结构搜寻（虚拟筛选）根据受体结合部位的特性，在小分子化合物数据库中进行三维结构搜寻，然后以搜寻到的结构为出发点，进行结构改造，使其与受体受点充分匹配。这类方法首先要建立大量化合物(例如几十至上百万个化合物)的三维结构数据库，然后将库中的分子逐一与靶标分子进行“对接”(docking)，通过不断优化小分子化合物的位置(取向)以及分子内部柔性键的二面角(构象)，寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，计算其相互作用及结合能。在库中所有分子均完成了对接计算之后，即可从中找出与靶标分子结合的最佳分子(前50名或前100名)。这类方法虽然计算量较大，但库中分子一般均是现存的已知化合物，可以方便地购得，至少其合成方法已知，因而可以较快地进行后续的药理测试，实际上这种方法就是在计算机上对几十万、上百万化合物通过分子对接的理论计算进行一次模拟“筛选”。只要库中的化合物具有足够大的分子多样性，从中搜寻出理想的分子结构就是可能的。

例如等人以计算机辅助三维结构搜寻，设计了非肽类HIV-1蛋白酶（HIV-PR）抑制剂：根据HIV-PRX-射线晶体学三维结构，采用DOCK（1.1版）程序，搜索小分子结构数据库——剑桥结构数据库（CambridgeStructureDatabase,CSD)先用程序产生分子的表面和腔穴，然后建立受点的反转影像，产生近似圆柱体的腔，用中心匹配算法来确定每个小分子能否置于其中，将化合物数目减少至1万个。然后将各小分子以不同方向与受点尝试配合，将评分最高的方位贮存起来。用软件包MidasPlus检测排在前面200位的分子，用以下标准评价所选化合物能否成为分子模板：模板中至少有一个原子能和酶的Asp25或Asp25’侧链上的任一羰基亲和（<0.4nm)与酶表面配合部位形成氢键配基易于合成应用此标准排除许多配基分子，得到的主要侯选分子为溴哌啶醇。生物活性测定选用商品化化合物氟哌啶醇，结果表明氟哌啶醇能抑制HIV-1和HIV-2蛋白酶。虽然氟哌啶醇作为抗精神病药物正常治疗血清浓度<0.03μmol/L，而抑制HIV浓度要比之高1000倍，无法应用于临床，但可作为开发抗病毒药物的一个有用的先导化合物。再例如Lam等人以类似方法设计新型非肽类HIV-PR抑制剂——环脲化合物。从肽类抑制剂与HIV-PR复合物的结构可知：抑制剂与HIV-PR二聚体结合中存在四配位水分子，此水分子从HIV-PR的Ile50和Ile50’残基上的酰胺基氢上获得两个氢键，并提供两个氢键与抑制剂上的羟基氧结合。基与此，将线性的肽变为环状非肽结构。从抑制剂-HIV-PR复合物结构得出一个简单的药效基团，它包括两个关键的分子距离：对称的疏水性基团P1和P1’间距离从P1和P1’到Asp25和Asp25’之间的距离筛选出一些高选择性的HIV-PR抑制剂。3、模板定位法即先在受体的受点处用模板构建出一个形状互补的三维分子骨架，再根据受体的性质将分子骨架转化为具体的分子结构，其过程前一步称为一级结构生成，第二步称为二级结构生成。4、原子生长法全新药物设计根据靶点的性质，如静电、氢键和疏水性等，逐个地增加原子，配成与受点形状和性质互补的分子。如原子生长的发明者Nishibata和Itai用原子生长分子设计程序尝试了大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂，通过DHFR三维结构分析，选择3个氢键原子，即Asp27的羧基氧原子、Ile5和Ile94的羰基氧原子作为锚原子。执行LEGEND程序，采用以下条件：产生最大分子数为300；最小和最大阈能分别为25kJ/mol和50kJ/mol；产生原子的最大重复次数为20；返回生成原子的最大重复次数为3；分子结构中所含最小环为2；经程序自动生成300个结构，用LORE程序以能量和结构特性为参数，从中选择了9个结构，其中一些如下：5、分子碎片法全新药物设计包括碎片连接法和碎片生长法：碎片连接法首先要有储存各种碎片的碎片库和各种连接子的连接子库。操作时先在受体的受点区域产生网格，用探针原子分析受点的表面性质，将受点区域划分为不同能容纳一个碎片的子区域，然后搜寻碎片库，选择合适碎片，再从连接库中寻找合适的连接子将其拼接起来。碎片生长法与原子生长法类似。但在受体受点的定位上，根据性质、形状的要求，以碎片而不是原子逐个地生长来构建一个分子。碎片生成的起始点可以是受点上指定的种子原子，也可以是从碎片库中得到的或作为配基的一部分的连接在受点上能量合适的碎片，称为核心碎片。(二）、间接药物设计1.活性类似物法（activeanalogueapproach，AAA）。由Mashall于1979年提出，又称共同模板假设（commontemplatehypothesis）或共同构象假设。这一方法从不同结构的生物活性配基的低能构象中，抽提出关键的特征进行各配基构象的重叠，推测得到假设的同一受体受点作用所必须的空间结构。而无活性化合物的总体积代表着受体中的“禁区”，即该部位已被受体的残基占据，而不能容纳配基。这样就能间接地得知受体的三维作用点。2、定量构效关系（Quantitativestructure-activityrelationship,QSAR)它对一组小分子化合物的理化参数和生物活性数据进行线性回归，拟合各项参数，得到反映化合物构-效关系的方程，可用于预测新化合物的生物活性，设计具有更高活性的药物分子。OSAR研究中常用的方法有Hansch法、Free-Wilson法、分子连接法、模式识别、人工神经网络等方法，量子化学计算的方法也已渗透到药物研究领域。Hansch法由Hansch等人于20世纪60年代提出，该理论认为药物的生物活性与药物分子的理化参数如脂水分配系数、电子效应、空间效应等参数相关，且大多数理化参数都具有加和性。通过统计学方法导出这些理化参数与生物活性的关系式，即Hansch方程：式中各参数含义：C为化合物产生指定生物效应的浓度；π为疏水性参数，药物分子疏水性是以药物分析脂水分配系数P的对数logP表征的，可从文献中查得。σ为电性参数，正值表示为吸电子基，负值为推电子基。Es

为立体参数，TaftEs是经典的立体参数，其定义为：式中kx和kH分别是取代乙酸酯和乙酸酯在酸性介质中的水解速率常数，影响速率常数大小的主要是立体因素k1、k2、k3和k4是代表各项因素贡献大小的系数。3、3D-QSAR药物分子与受体之间的作用是在三维空间进行的，因此要准确地描述药物的结构与生物活性的关系，必须知道药物分子乃至受体分子的三维结构，建立更加合理的模型。三维定量构效关系是以配基和受体的三维结构特征为基础，根据分子的内能变化和分子间相互作用的能量变化来定量地分析三维结构与生物活性间的关系。Hansch分析一般只能处理分子的二维结构，属于2D-QSAR，直到20世纪80年代中期才由Cramer等提出了3D-QSAR系统的研究方法。3D-QSAR常用的方法有假想受点点阵（HASL）、分子形状分析（MSA）、比较分子场分析（CoMFA）等，这里简单介绍CoMFA法的基本过程：①.构建出分子的三维结构以分子力学和量子化学计算被研究化合物的优势构象，按照合理的重叠规则和根据对药效图形的推测和判断，把这些分子三维结构重叠在一个包容全部化合物分子的空间网格上。②选择一个合适的探针原子、基团或分子，在网格中以一定的步长移动（通常为2埃），计算每个点与化合物构象式间的立体排斥能、静电热和疏水作用，确定化合物分子周围各种作用力场的空间分布。将它们和各化合物的生物活性共同构成ComFA的QSAR数据表。③数据统计分析：由于网格点的数目比化合物的数目大的多，因而采用偏最小二乘法进行回归，建立3D-QSAR方程。④用得出的3D-QSAR方程预测未知物的活性，指导下一步合成，并通过生物活性验证以判断3D-QSAR的正确性。4、基于药效基团的间接药物设计药效基团模型法，是对一系列活性化合物进行3D-QSAR(三维定量构效关系，3D-quantitativestructure-activityrelationship)研究，并结合构象分析，得出该类药物的药效学基团模型，以此模型预测新化合物的活性。其方法可分为以下几步：根据化合物活性将其分类。在整个构象空间搜索最低能量构象，建立分子的三维药效基团模型，然后计算出用于识别药物基团的各种电性性质、疏水性质和体积性质描述符，如芳香环中心，亲脂区域，电子和氢键供体、受体等。识别出属于同一活性级别所有化合物的共同结构模式，并统计它在各个活性级别化合物中出现的频率，由此确定药效基团的统计参数。叠加同一药效基团分子，并进行优化，确定某类药物具有的药效基团。预测新化合物活性。例如法国Hibert等报道5-HT3受体拮抗剂的设计：首先测得一系列已知化合物，如甲氧氯普胺、可卡因等9个药物的5-HT3受体结合活性。用SYBYL5.2软件来定义药效基团，每个化合物逐步旋转单键和增加二面角，确定其能量允许的构象，在根据分子特性进行最佳拟合，得到各构象式的重叠图。计算机辅助药物设计简介计算机辅助药物设计简介计算机辅助药物设计山东大学药学院周均愫指导老师：方浩Computer-aidedDrugDesign,CADD引言建国以来，我国的药学研究和医药产业有了很大的发展，但总体上仍以仿制为主，自己创制的新药仅占2％-3％。随着国际上知识产权保护的各项法规在我国逐步实行，新药的研制已日益显示出其重要性和紧迫性。然而，新药的寻找至今仍是一件耗资巨大而效率很低的工作，据国际上近年来的统计，研制成功一种新药，平均需要花费10～12年的时间，耗资2.0亿～3.5亿美元，并且这一费用正以每年20％的速度递增。近年来，应用各种理论计算方法和分子模拟技术，进行计算机辅助药物设计(Computer-aidedDrugDesign,CADD)，已成为国际上十分活跃的研究领域。计算机辅助药物设计的概念计算机辅助药物设计（computer-aideddrugdesign，CADD）是以药物分子的基础，是新药研究的工具。它依据生物化学、酶学、分子生物学以及遗传学等生命科学的研究成果，针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道以及核酸等潜在的药物设计靶点，并参考其他内源性配体或者天然药物产物的化学特征，设计出合理的药物分子。

CADD方法能加速药物先导化合物的发现。目前药品专利的保护期限为20年，如果药物上市前研究与开发(R&D)花费的时间为10年，那么药品的有效市场销售时间就仅有10年。如果R&D时间能缩短2～3年，那么不但能节约R&D的经费，而且能为市场赢得宝贵的时间，这将产生巨大的经济效益和社会效益。因此，CADD方法已被国外许多制药公司用于新药的研究与开发，并且近年来已取得了极大的成功。所以，CADD方法与应用的研究不但具有深远的科学意义，而且具有巨大的应用价值。从药物的发展史来说--最原始的筛选药物方式—神农尝百草--大规模的整体动物实验方式--分子细胞水平的体外筛选方式从筛选药物的范围来看--随机筛选法：从自然资源中或已有的化学库（包括组合化学库）中筛选组合化学物--经验式重复筛选法：利用传统药物化学手段合成化合物进行构效优化评价--药物合理设计与筛选法：基于靶点分子结构进行靶点药物的评价药物的筛选方式确定靶点寻找先导化合物Ｒ基修饰药效基团模型动物实验三维构效关系分子对接活性预测毒性预测化学合成基于靶点的药物设计流程数据库、同源模建数据库、文献、合成小分子的三维结构构效关系方法药效团模型方法大分子的三维结构分子模拟计算机辅助药物设计分子对接方法从头设计方法数据库搜索方法虚拟组合化学方法ADME/TOX预测组合合成及高通量筛选可能的先导化合物合成及活性测定先导化合物的优化AminoAcidsequence化合物实体确定蛋白质三维结构和活性位点QSAR预测&药效基团分析ADME预测数据库管理&组合化学&高通量筛选

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确定靶点当前测定蛋白质结构的主要方法仍然是X单晶衍射学方法和多维NMR技术。应用X射线晶体学方法测定蛋白质结构的前提是获得能对X射线产生强衍射的单晶，而蛋白质晶体的表达、提纯与结晶增加