中职-病原生物与免疫学基础课件实验部分学习资料

病原生物与免疫学基础实验指导

一、实验目的

病原生物与免疫学基础实验是本课程重要组成部分，是理论与实验研究的技术基础。通过实验，加深学生对基本理论知识的理解；通过实验操作，掌握有关的基本操作技能和无菌技术，建立无菌观念；通过正确地观察和分析实验结果，培养学生实事求是的科学态度、严肃认真的工作作风及分析和解决问题的能力。

二、实验要求

1.在每次实验前必须复习相关理论知识，预习实验内容，对实验的目的、要求、方法和步骤做到心中有数。 2．实验过程中，加强无菌观念，严格无菌操作，操作时必须戴口罩，不要开风扇。 3．实验过程中，坚持实事求是，认真分析，真实记录实验结果，如实验结果与理论不符，应查找原因。 4．对实验过程与结果应认真观察并记录之，及时写出实验报告。

三、实验室规则

本门课程的实验操作对象多为病原生物，具有一定的传染性。因此，必须严格遵守实验室规则，按要求进行操作，防止发生实验室感染。1.进入实验室应穿白大衣，离开实验室前脱下并反折放好，要经常清洗，保持洁净。2.非实验必要的物品如书包等，不得带入实验室。带进实验室的教材和文具，要远离操作部位，以免污染。 3．禁止在实验室内饮食、吸烟或用嘴湿润标签、铅笔等。 4．实验时不得高声谈笑和来回走动，以保证实验室的安静、有序，利于集中精力完成实验操作。 5.实验中需要进行培养的微生物，应做好标记及处理方法。

6．要爱护室内仪器设备，按使用规则操作，并应节约使用实验材料，凡属操作不当损坏者，需报告老师，进行登记。 ７．凡具有传染性的培养物、带菌材料、动物等，均需按要求处理，不得随便乱放或用水冲洗。实验室内任何物品未经许可，不得携带出室外。 ８．各种实验物品应按指定地点存放，用过的玻璃器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌面及冲入水槽。实验中如发生差错或意外事故时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒，以免发生传染。 ９．实验结束，应清洁实验仪器，擦净桌面，归类放好物品，并用消毒液泡手，再以清水冲洗干净。值日生负责实验室的卫生清洁，关好水电、门窗，方可离开实验室。 10．认真观察并做好实验记录，对需连续培养观察的实验，应每次记录好观察现象和结果，以便分析并应实事求是地写好每次实验报告，实验报告要简洁、准确、清楚。

实验一细菌形态检查【实验目的】 １.学会：显微镜油镜的使用和保护方法 ２.掌握：显微镜采光的方法要点 ３.能够辨认：细菌的基本形态和特殊结构 ４.学会：制备细菌涂片及革兰染色方法和结果判断

【实验内容及方法】一、显微镜油镜的使用和保护方法(操作)

（一）油镜原理

（二）油镜使用方法

（三）显微镜的保护

（一）油镜原理细菌个体微小，必须借助显微镜油镜放大1000倍才能看到。因玻璃和香柏油折光率相近似(约为1.52)，所以在玻片上加一滴香柏油，把玻片与油镜头连接，使由聚光器照射上来的光线通过玻片和香柏油时，不发生折射而直接进入透镜的光量增多，视野亮度增强，因而获得清晰的物象(实验图1-1)。

实验图1-1油镜的原理

（二）油镜使用方法

1．放置显微镜2．对光①聚光器上升到与载物台持平。②以自然光为光源时，宜用平面镜对准光源；采用人工灯光为光源时，用凹面镜对准光源。③光圈完全打开。

3．转换油镜头油镜头的三个标志：①油镜头上标有100×；②镜头前端有白色圆圈；③刻有“油”或“Oil”字样。

4．调节焦距 5．观察方法6．擦镜 7．显微镜还原

（三）显微镜的保护

1．显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心爱护，不得随意拆御和碰撞。 ２.取送显微镜时应轻拿轻放，一手握镜臂，一手托镜座，防止因震动使镜头受损。 ３．显微镜的调节器只能做有限的旋转，当旋转感到有阻力时应立即向反方向旋转退回，以免碰撞损坏镜头。细调节器用于焦距的细微调节，使用时转动不宜超过360o，如需要较大幅度调节时，应使用粗调节器。４.使用显微镜要轻拿轻放，平时放置要注意通风干燥，防尘防霉防晒。

二、细菌的基本形态和特殊结构观察(示教)

（一）细菌的基本形态观察（二）细菌的特殊结构观察

（一）细菌的基本形态观察

使用显微镜油镜，观察各种球菌、杆菌和螺形菌的革兰染色标本片，以认识细菌的基本形态。观察时应注意细菌的形状、大小、排列方式、染色性，同时绘图记录。

1．球菌①葡萄球菌：菌体正圆形，呈葡萄串状排列，染成紫蓝色，为革兰染色阳性球菌；②链球菌：菌体正圆形，呈链状排列，染成紫蓝色，革兰染色阳性球菌；③脑膜炎奈瑟菌：菌体肾形，成双排列，染成红色，为革兰染色阴性球菌。

2.杆菌大肠埃希菌，菌体短杆状，呈分散排列，染成红色，为革兰染色阴性杆菌。３.螺形菌霍乱弧菌，菌体呈弧形，呈分散排列，染成红色，为革兰染色阴性弧菌。

（二）细菌的特殊结构观察

观察示教镜下伤寒沙门菌的鞭毛、肺炎链球菌的荚膜、破伤风梭菌的芽孢。注意细菌菌体与特殊结构的形状、染色性、大小、位置等形态特点，并绘图。１．鞭毛伤寒沙门菌鞭毛染色标本片，菌体较粗大、杆状，染成红色，分散排列，周围可见到波浪状弯曲、较长、呈红色的鞭毛。2．荚膜肺炎链球菌荚膜染色标本片，视野背景为蓝色，菌体呈纵向成双排列呈双瓜子状或链状，菌体周围有未染上颜色的空白发光区，即荚膜。3．芽孢①破伤风梭菌芽孢的革兰染色标本片，菌体为革兰染色阳性长杆状，顶端有不着色的圆形空白区，并大于菌体宽度即芽孢，似“鼓槌状”，视野中其他散乱分布的无色球体，为菌体脱落的成熟芽孢。②炭疽芽孢杆菌革兰染色标本片，菌体粗大杆状，呈链状排列，似竹节状，染成紫色，为革兰染色阳性杆菌。菌体中间有卵圆形的小于菌体的芽孢

三．细菌涂片标本制作和革兰染色法(操作)（一）革兰染色法原理 （二）实验材料 （三）实验方法

（一）革兰染色法原理

由于细菌的等电点低（在PH2～5之间）且带负电荷以及细胞壁结构的差异等原因，革兰染色阳性菌可牢固结合带正电荷的碱性结晶紫，不易被酒精脱色，故仍保持初染的紫蓝色；革兰染色阴性菌等电点较革兰阳性菌等电点高，结合结晶紫不牢固，易被酒精脱色．故复染呈红色。

（二）实验材料

1．菌种大肠埃希菌、葡萄球菌培养物。2．其他革兰染色液、载玻片、生理盐水、香柏油、酒精灯、接种环、擦镜纸、火柴等。

（三）实验方法

1．制片细菌涂片标本制作的基本步骤为：

①涂片：取生理盐水各一滴，滴于玻片两侧，以无菌操作的方法，用无菌接种环挑起培养基上葡萄球菌培养物少许，在玻片一侧的盐水中磨匀，涂布成约1cm×1cm大小的圆形薄膜；再用无菌接种环挑起培养基上大肠杆菌培养物少许，在玻片另一侧的盐水中磨匀，也涂布成约1cm×1cm大小的圆形薄膜。

②干燥：把涂好的玻片置于室温中自然干燥，或将菌膜面朝上置于酒精灯火焰上方不烤手的高处微微烘干。

③固定：将已干燥的涂片膜面向上，玻片与酒精灯火焰接触，在火焰外焰上水平地快速来回通过火焰3次，予以固定，注意不可将菌体烤焦。把固定好的玻片置于染色槽上冷却，待冷却后进行染色。

2．染色

（1）初染：滴加结晶紫染液于涂膜上，染色1min后，用水轻轻冲洗。

（2）媒染：滴加碘液，约1min后，水洗。

（3）脱色：滴加95％乙醇溶液脱色，轻轻摇动玻片至无紫色脱出为止，0.5～lmin后(视涂片的厚薄程度而定)，水洗。

（4）复染：滴加释稀复红，染色0.5～1min后，水洗。3．镜检将标本片用吸水纸吸干，加一滴香柏油后用显微镜油镜观察。4．结果葡萄球菌染成紫蓝色，为革兰阳性菌；大肠杆菌染成红色，为革兰阴性菌。

【实验作业】

(1)列出显微镜油镜头的三个标志。(2)写出油镜使用时采光的方法要点。(3)绘出镜下所见的细菌基本形态和特殊结构图。

(4)记录革兰染色的结果，并进行分析。

实验二细菌的培养与代谢产物观察（示教）【实验目的】 1.掌握固体培养基、半固体培养基、液体培养基的用途。 2.熟悉细菌在固体培养基、半固体培养基、液体培养基的生长现象。 3.了解细菌的接种技术及无菌操作技术概念 4.了解基础培养基制作的过程

【实验内容及方法】

一、基础培养基的制作二、细菌接种法与培养三、观察细菌在培养基中的生长现象四、细菌代谢产物的观察

一、基础培养基的制作基础培养基按物理性状分为固体、半固体和液体培养基三种。培养基的制备程序可分：配料→溶化→测定及矫正pH→过滤→分装→灭菌→检定→保存备用。

（一）肉膏汤培养基1.成分：牛肉膏0.3g 蛋白胨1g 氯化钠0.5g 蒸馏水100ml2.制法： （1）用天平分别称取牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g置三角烧瓶中。 （2）加入蒸馏水100毫升，把三角烧瓶用酒精灯或电炉加热，使蛋白胨等溶解。 （3）测定培养基的酸碱度。调整至pH7.6(可用pH试纸测定)。必要时用滤纸过滤。 （4）分装试管或烧瓶，塞上棉塞，用玻璃纸包扎管口、瓶口。 （5）高压蒸汽灭菌103.42kPa20min取出冷却后冰箱贮存备用。3.用途：肉膏汤培养基主要用于增菌。

（二）固体培养基1.成分：肉膏汤培养基100ml

琼脂2g~3g2.制法： （1）在上述制备的肉汤中加入琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到85℃后可溶化，冷却至40℃左右又可凝固，故可作为固形剂。加热使所有的琼脂全部溶化，以纱布和脱脂棉过滤，补足蒸发的水，分装三角烧瓶和试管。 （2）置高压灭菌器内103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸气压力下，灭菌20min，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基（实验图2-1）。三角烧瓶内培养基冷至50℃～60℃时在超净台或无菌室内将其倾注于灭菌平皿内（15ml～20ml），凝固后即成琼脂平板，放置冰箱中备用。

3.用途：普通琼脂培养基主要用于细菌的分离、鉴定、计数、保存菌种。

（三）半固体培养基1.成分：肉膏汤培养基100ml琼脂

0.5～1g2.制法：

（1）将0.5g～1g琼脂加到100ml肉膏汤中，加热溶化，调整至PH7.6。 （2）分装试管，每管约2ml～3ml，灭菌后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。3.用途：半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。

二、细菌接种法与培养（一）平板分区划线接种法（二）斜面培养基接种法（三）液体培养基接种法（四）半固体培养基接种法

（一）平板分区划线接种法

该法多用于获得细菌的纯种。

1.标记在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期等。

2.灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置酒精灯的火焰中烧灼至通红灭菌，如实验图2-2，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2～3次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距火焰10cm范围之内（视此范围为无菌环境）；灭菌后的接种环不能再碰其它物体。

实验图2-2接种环的灭菌操作

3.取菌种左手持装有葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管硅胶塞，将试管管口迅速通过火焰外焰2～3次进行灭菌。将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的混合菌液，然后退出菌种管。将菌种管管口再次通过火焰外焰2～3次灭菌，塞好硅胶塞，放至原来的位置。

4.分区划线接种细菌（实验图2-3）实验图2-3分区划线接种细菌

（1）左手持平板培养基，在火焰上方打开平皿盖，打开角度不能超过45°，将挑取菌种的接种环在平板培养基的边缘部分涂抹，接种环烧灼、冷却，自涂抹部分开始，做不重叠来回连续划线，第一区划线面积约占平板的1/4。 （2）再次烧灼灭菌接种环，冷却，将培养基转动80°左右，进行第二区划线，第二区划线与第一区划线有2～3条相交。烧灼接种环后用相同的方法进行第三区、第四区划线。 （3）接种环烧灼灭菌，接种完毕。在平板底部作上记号，放入37℃温箱中培育24h后观察结果。注意观察最后1～2区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、边缘、表面、颜色、透明度等情况）。

（二）斜面培养基接种法

斜面培养基多用于纯种增菌。 1.在待接种的琼脂斜面培养基试管壁上贴上标签纸，作好标记。 2.以无菌操作，用灭菌的接种环从发给的菌种上取菌少许（如为琼脂平板培养物应取单个菌落）。 3.按无菌操作手续，将所取细菌自琼脂斜面的底部向上轻轻作曲线划线接种。置37℃温箱培养18～24h。 4.观察结果并记录。

（三）液体培养基接种法

1.在待接种肉汤管上写明标记或贴上标签。 2.左手握持菌种管及待接种的肉汤管，菌种管在外侧。 3.倾斜肉汤管，接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨，使菌混于肉汤中。塞好试管硅胶塞后，轻轻摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。 4.接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉汤管放37℃温箱培养，18～24h后观察生长情况（观察液体有无混浊、沉淀、颗粒状、菌膜、色泽等）。

（四）半固体培养基接种法

半固体培养基用于观察细菌有无动力或保存菌种。有动力的细菌除在穿刺线上生长外，还可以向四周弥散生长，使整个培养基变混浊或呈羽绒状；而无动力的细菌只沿着穿刺线生长，穿刺线以外的培养基仍澄清。 此试验分2组，一组用葡萄球菌或痢疾杆菌，另一组用枯草杆菌或大肠杆菌。 1.在待接种的半固体培养基试管上贴好标签。 2.与液体培养基接种法相同，左手握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。 3.右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，从半固体培养基的中心垂直刺入，达底部（但不能与管底接触，距离管底约4mm），然后沿原穿刺线路退出（实验图2-4）。 4.接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架上，塞好硅胶塞，37℃培养18—24h小时后取出观察细菌的生长情况并记录。

实验图2-4斜面、液体、半固体培养基接种法

三、观察细菌在培养基中的生长现象（一）固体培养基上的生长现象（二）液体培养基中的生长现象（三）半固体培养基中的生长现象

（一）固体培养基上的生长现象 标本或培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落。多个菌落密集生长融合连成一片叫菌苔。注意观察菌落的大小、形态、透明度、颜色、湿润度、表面是否光滑或凸起或凹陷，边缘是否整齐及菌落周围有无溶血环等。

（二）液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中有三种生长现象：

均匀混浊（葡萄球菌）沉淀生长（链球菌）

形成菌膜（枯草芽胞杆菌）

（三）半固体培养基中的生长现象

有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线周围可见羽毛状或云雾状混浊生长（枯草杆菌或大肠杆菌），动力阳性。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线周围的培养基仍然澄清透明（痢疾杆菌或葡萄球菌），动力阴性。 细菌在固体、液体和半固体培养基中的生长现象（实验图2-5）。

实验图2-5细菌在固体、液体和半固体培养基中的生长现象

四、细菌代谢产物的观察（一）细菌对糖类发酵作用——糖发酵试验（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用（三）尿素分解试验（四）色素的产生

（一）细菌对糖类发酵作用——糖发酵试验

取葡萄糖,乳糖发酵管各二支（注意管内的小倒管应充满液体，不含气泡），各管分别接种大肠杆菌、伤寒杆菌，种毕，置37℃培养18～24h，取出看结果，并以下列符号作记录：

：表示分解糖、产酸产气。培养基指示剂（溴甲酚紫）由紫色变黄色，小倒管内有气泡。 +：表示分解糖，产酸不产气。 －：表示不分解糖，不产酸不产气。

（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用

1.吲哚试验：取蛋白胨水培养基二支，分别接种大肠杆菌与伤寒杆菌，种毕，置37℃培养18～24h，取出检查。沿管壁徐徐加入约0.5ml的吲哚（靛基质）试剂于培养物中，若见试剂与培养基的接触面出现红色，则试验为阳性；若不出现红色，则试验为阴性，记录结果。

2.硫化氢试验：取醋酸铅培养基二支，分别接种大肠杆菌与变形杆菌或乙型副伤寒杆菌，种毕，置37℃培养18～24h。取出观察结果，按下列符号记录：+：出现黑色，表示产生硫化氢。－：颜色不变，表示不产生硫化氢。

（三）尿素分解试验

尿素培养基的主要成分：尿素水溶液、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、酚红（指示剂）。培养基呈淡红色。 某些细菌（如变形杆菌）具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氮，使培养基变碱性，指示剂呈红色（阳性反应）；不分解尿素者（如伤寒杆菌），培养基颜色不变（阴性反应）。尿素培养基中含有的葡萄糖、蛋白胨，供作接种菌的营养物，两者的量有一定比例，使分解葡萄糖生成的酸和分解蛋白胨生成的碱性化合物基本相互抵消；同时培养基中尚有磷酸二氢钾缓冲剂的存在，故此两物质对培养基的酸碱度影响不大。如接种的细菌分解葡萄糖产酸过多，使pH值下降，也可使培养基颜色变黄。 取尿素培养基二支，分别接种伤寒杆菌和变形杆菌，置37℃培养18～24h，观察结果并作记录。

（四）色素的产生

取普通琼脂斜面（或平碟）培养基2支（个），分别接种金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌于培养基上，种毕，放37℃培养18～24h取出观察是否有色素产生，并作记录。

【实验作业】1．写出各种培养基制备的方法。2．写出三种培养基的用途。3.记录细菌在普通平板,液体培养基,半固体培养基中的生长现象。4.说明在接种细菌时要注意哪些无菌操作。

实验三细菌的检查及消毒灭菌（操作）【实验目的】

1.掌握：无菌操作技术。

2.熟悉：高压灭菌器的使用及使用注意事项；紫外线灭菌。

3.了解：细菌的接种技术；药敏试验在临床应用的实际意义。

【实验内容及方法】一、细菌的分布检查二、咽喉部细菌的检查及皮肤消毒试验三、常用消毒灭菌器介绍（示教）四、药物敏感试验（纸片法）（示教）

一、细菌的分布检查

（一）空气中细菌的检查

取普通琼脂平板2个，分别置于实验室内和消毒过的无菌室或超净工作台上，打开平皿盖暴露10分钟，盖上平皿盖，做好标记，37℃培养24小时后观察结果。

（二）水中细菌分布检查——倾注平板分离法

1．取已灭菌的1毫升吸管，套上胶头。 2．右手持吸管带胶头的一端，其余部分迅速通过火焰外焰，以再灭除吸管表面可能存在的细菌。 3．以挤压胶头的办法，吸取1ml自来水，置于无菌空平皿中（注意不要错放入平碟盖内）。 4．取一瓶已融化并冷却至50℃左右（手握琼脂管感觉热而不烫手）的琼脂培养基，取去硅胶塞，管口通过火焰外焰灭菌，迅速倾入已盛有1ml自来水的平皿中，立即加上平皿盖，在实验台上轻轻水平摇动，使琼脂与水样充分混合，静置台面，等待琼脂凝固。

5．琼脂凝固后，将平皿倒放（即平皿底在上，盖在下）。置于37℃温箱培养18～24h，取出观察结果。计算每毫升自来水菌落数，对结果给予评价。

二、咽喉部细菌的检查及皮肤消毒试验

（一）咽喉部细菌的检查

取血平板1个，在平皿底部正中画一直线分为两部分，分别做好标记，由两位同学用无菌操作分别将咽喉部棉拭子标本涂于血平皿表面的相应位置，然后再用接种环画线分离，37℃培养24h后观察结果（注意是否有细菌菌落、菌苔及溶血环）。

（二）皮肤消毒试验

每两名学生用一个琼脂平皿，先在平皿底部帖上标签纸，纸上分5格，标明序号，两人用未消毒手指分别在1、2格内涂布，然后用2%碘酊消毒手指后再分别涂抺3、4格，余下第5格作为空白对照，盖上皿盖，置37℃温箱培养24h后观察结果。

三、常用消毒灭菌器介绍（示教）（一）高压蒸汽灭菌器（二）干烤箱（干热灭菌器）（三）紫外线杀菌试验

（一）高压蒸汽灭菌器

高压蒸汽灭菌器是应用最广的灭菌器，凡能耐高温不怕潮湿的普通培养基、敷料、手术器械、药品、注射用液体和玻璃器皿等，均可用此法灭菌。

1.高压蒸汽灭菌器的构造：手提式蒸汽灭菌器是一双层金属圆桶。外层坚厚，能承受一定的压力，外层顶端有金属厚盖。有的灭菌器盖旁加有螺旋，借以紧闭此盖，有的则借助弹力将盖顶上，防止蒸汽外溢。盖上装有排气阀门、内连通气管、安全活塞和温度压力表。内层金属筒的内壁有安置通气管的金属槽。（见实验图3－1）

实验图3－1手提式高压蒸汽灭菌器示意图

2.高压蒸汽灭菌器使用法：

（1）先在外层内加适当的水，然后放入内层金属筒。将待灭菌物品放入内层金属筒里，加盖，注意要把盖上的通气管放入内壁金属槽内。旋紧螺旋使之密闭，同时打开排气阀门。 （2）放炉上加热或插上电源。 （3）温度逐渐上升时，装入的水汽化，随着压力的增高，迫使器内冷空气先由排气阀驱出，继则有蒸汽出现，待有大量蒸汽喷出时（呈白色雾状气流，并发出哨音）即可认为器内冷空气已被排尽。 （4）关闭排气阀门，此后器内压力逐渐升高。随着蒸汽压力的增高，内部温度也随之升高。温度随压力升高的情况见实验表3-1。直到压力表指示到103kpa(15磅／吋2)时，器内温度可达到121.3℃。此时调节热源使压力和温度维持在此数值，维持15～20min，即可达到灭菌的目的。（5）灭菌时间达到后，停止加热，待压力自行下降至零时，才能开盖取物。

3.使用高压蒸汽灭菌器注意事项：

（1）灭菌开始时，必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力不完全是蒸汽压力，灭菌将不彻底。 （2）灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免灭菌的瓶内液体因压力突然降低后冲出外溢。 （3）放置需灭菌的物品不应太挤。根据物品体积的大小或污染的情况可适当调整灭菌时间。总之用高压蒸汽灭菌器灭菌时，要做到“安全生产”。

（二）干烤箱（干热灭菌器）

干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石棉，箱底有热源（电炉），并附有温度计和自动调节器。灭菌时，加热箱内空气，靠热空气灭菌。主要用于耐高温，怕潮湿的物品灭菌。如玻璃器皿、试管、吸管、三角烧杯、油剂、粉剂等灭菌。用时将需灭菌的物品经清洗和晾干之后，整齐排放在箱内，不宜过挤，关闭两层箱门，通电，排冷气后关上排气孔，待温度升到160～170℃，维持2h，可达到灭菌目的。灭菌完毕，关闭电源，待温度自然下降至50℃以下才能开门取物，以防玻璃器皿骤冷发生爆裂。

（三）紫外线杀菌试验

原理：紫外线在波长200nm～300nm时具有杀菌能力，但穿透力不强，可被普通玻璃及纸片所吸收。用途：常用于手术室、无菌室、病房、治疗室等的空气消毒。 取普通琼脂平板一个，均匀密集画线接种大肠杆菌，用无菌镊子把经灭菌的方形纸片帖于平板表面中央部分。打开平皿盖，置紫外线灯下距离20～30cm处照射30分钟，除去纸片，盖好平皿盖，置37℃温箱培养24小时后观察结果。

四、药物敏感试验（纸片法）（示教）

（一）取琼脂平板2个，大肠杆菌斜面培养物及葡萄球菌斜面培养物各1支。 （二）将大肠杆菌密集划线接种在整个平皿表面上，使细菌均匀密集地分布于整个平皿。用同法将葡萄球菌接种于另一平皿。 （三）无菌操作用镊子取药敏纸片，按标记位置帖在涂布细菌的培养基表面，用镊尖压一下，使其帖平，一次帖好，不得移动。纸片一帖上就不可再拿起，因纸片中的药液已扩散到琼脂中。每张纸片中心间距不少于24mm，纸片中心距平板边线距离不少于15mm。直径为90mm的平皿最多帖6片。 （四）帖上纸片后，须在15分钟内置37℃温箱培养24小时后观察并记录结果。

（五）结果报告测量抑菌圈（无细菌生长的环）的直径，结合药物的性质，一般以敏感、中度敏感、耐药三个等级报告结果。（见实验图3－2）

实验图3－2药物敏感试验

敏感（S）：指细菌被常用剂量的抗菌药物所抑制。

中介（I）：指细菌被高于常用剂量的抗菌药物所抑制，但治疗指数低（即治疗量与中毒量接近）；或者是敏感与耐药之间的缓冲带，为实验误差造成。 耐药（R）：指细菌不被常用剂量的抗菌药物所抑制，治疗效果差。不同细菌对相同或不同药物的敏感度可有不同的判断标准（见实验表3－2）

实验表3－2常用药敏实验纸片判断标准 细菌抗菌药物抑菌圏直径（mm）

R

IS 葡萄球菌青霉素≤28－≥29 红霉素≤1314～22≥23 氨苄西林≤28－≥29 头孢唑啉≤1415～17≥18 庆大霉素≤1213～14≥15 四环素≤1415～18≥19 环丙沙星≤1516～20≥21 磺胺药≤1213～16≥17 肠杆菌科氨苄西林≤1314～16≥17 头孢唑啉≤1415～17≥18 庆大霉素≤1213～14≥15 四环素≤1415～18≥19 环丙沙星≤1516～20≥21 磺胺药≤1213～16≥17

【实验作业】1.记录并分析空气中、水的、物品上、咽喉部细菌的分布检查结果。2.记录并分析煮沸消毒、紫外线杀菌、皮肤消毒的消毒灭菌实验结果。3.记录并分析纸片法药物敏感试验结果。

实验四免疫学基础实验【实验目的】1.掌握玻片凝集反应的原理、方法及结果判定2.熟悉胎儿胸腺、骨髓、雏鸡腔上囊、淋巴结、脾脏的形态与功能3.熟悉吞噬细胞吞噬现象4.E-花环试验、淋巴细胞转化试验用途；HCG的检测方法及临床意义5.了解豚鼠过敏性休克的表现与原理6.了解试管凝集反应;ELISA双抗体夹心法；常用生物制品观察

【实验内容及方法】一、免疫器官与免疫细胞的观察（示教）二、豚鼠过敏性休克的观察（示教）三、抗原抗体反应四、常用生物制品观察（示教）

实验四免疫学基础实验【实验目的】1.掌握玻片凝集反应的原理、方法及结果判定2.熟悉胎儿胸腺、骨髓、雏鸡腔上囊、淋巴结、脾脏的形态与功能3.熟悉吞噬细胞吞噬现象4.E-花环试验、淋巴细胞转化试验用途；HCG的检测方法及临床意义5.了解豚鼠过敏性休克的表现与原理6.了解试管凝集反应;ELISA双抗体夹心法；常用生物制品观察

【实验内容及方法】一、免疫器官与免疫细胞的观察（示教）二、豚鼠过敏性休克的观察（示教）三、抗原抗体反应四、常用生物制品观察（示教）

一、免疫器官与免疫细胞的观察（示教）（一）胎儿胸腺、骨髓、雏鸡腔上囊、淋巴结、脾脏标本观察（二）吞噬细胞吞噬现象镜下标本观察（三）E花环与T淋巴细胞转化试验镜下标本观察

（一）胎儿胸腺、骨髓、雏鸡腔上囊、淋巴结、脾脏标本观察1.观察4～6个月龄胎儿胸腺标本。胸腺位于胸骨柄的后方，上纵隔的前部，由不对称的左右两叶组成，中间可见一条正中线。胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所。2.观察骨髓标本。骨髓是各种血细胞和免疫细胞发生和分化的场所，在哺乳类动物中，骨髓是B细胞产生、分化与成熟的器官。3.观察雏鸡腔上囊标本。腔上囊位于泄殖腔后上方，为一囊状淋巴组织，是鸟类B细胞产生、分化与成熟的器官。4.观察淋巴结和脾脏标本。淋巴结和脾脏均为外周免疫器官，是成熟T细胞、B细胞等免疫细胞定居的场所，也是产生免疫应答的部位。

（二）吞噬细胞吞噬现象镜下标本观察

用油镜观察被中性粒细胞吞噬的细菌和被巨噬细胞吞噬的鸡红细胞的染色标本。

1．中性粒细胞吞噬细菌的染色标本片

中性粒细胞核和细菌经瑞氏染色被染成紫色，中性粒细胞的胞浆被染成淡红色。称为小吞噬现象。

2．巨噬细胞吞噬鸡红细胞的染色标本片

巨噬细胞经瑞氏染色后核着色较深，多为马蹄形，胞浆着色较浅。鸡红细胞为椭圆形，核淡红色。称为大吞噬现象。

（三）E花环与T淋巴细胞转化试验镜下标本观察

1.油镜观察E花环试验染色标本片T细胞染成紫蓝色，核呈圆形，染色质呈块状，排列致密，胞质为新月形；其周围结合3个或3个以上染成红色的绵羊红细胞。（彩图4-1）正常值为50%～70%左右。

2.油镜观察淋巴细胞转化试验染色标本片

注意未转化的淋巴细胞与转化的淋巴细胞的不同形态特征。转化的淋巴细胞包括母细胞和过渡型细胞。母细胞的特点为正常细胞的4～5倍，核疏松呈网状结构并有1～3个核仁，胞浆丰富，嗜碱性，并可见空泡。过渡型细胞较正常细胞略大，核质较疏松，胞浆较多，嗜碱性。正常值为50～80%。

二、豚鼠过敏性休克的观察（示教）实验方法1.致敏注射取体重250克的豚鼠2只（其中1只为备用），每只腹腔或皮下注射1：10稀释的鸡蛋清溶液0.5ml，使之致敏，做好标记。2.发敏注射取致敏注射2～3周的豚鼠1只，心内注射1：2稀释的鸡蛋清溶液1ml；取未致敏的豚鼠1只，心内注射1：2稀释的鸡蛋清溶液1ml，作为对照。3.结果观察致敏豚鼠经发敏注射后数分钟，出现不安、竖毛、搔鼻、喷嚏、呼吸困难、抽搐、大小便失禁及痉挛性跳跃等反应，严重者死亡，解剖可见肺气肿。（实验图4－1）

实验图4－1豚鼠过敏性休克

三、抗原抗体反应（一）玻片凝集反应（操作） （二）试管凝集反应（示教）（三）早孕检测（四）ELISA双抗体夹心法（示教）

（一）玻片凝集反应（操作） 1.材料：（1）诊断血清：1：10稀释的伤寒杆菌诊断血清（2）菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物（3）生理盐水、载玻片、毛细吸管

2.方法：（1）取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内分别加1：10稀释伤寒杆菌诊断血清1～2滴，第三格加1～2滴生理盐水。（2）无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。（3）同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。（4）轻轻摇动玻片，经1～2min后肉眼观察有无凝集块

3.结果判断出现粉末状乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为均匀的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察（实验图4－2）。实验图4－2玻片凝集试验

（二）试管凝集反应（示教）

试管凝集试验为半定量试验方法。用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清（被检抗体）混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度。在试验中，由于电解质浓度和pH不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。

1.材料（1）1∶10稀释的伤寒杆菌免疫血清。（2）伤寒杆菌“O”菌液、伤寒杆菌“H”菌液。（3）生理盐水、小试管、吸管、试管架、水浴箱。

2.方法（1）取洁净小试管14支，依次用蜡笔标明管号。（2）用5亳升吸管取生理盐水，于每管中分别加入0.5亳升。（3）用1亳升吸管取伤寒杆菌血清1亳升，分别加入两排的第1管中，每管0.5亳升。（4）从第1管开始用上述吸管交血清生理盐水反复吹吸三次混匀，由第2管吸出0.5亳升加入第2管中，同法吹吸混匀后的吸出0.5亳升加入第3管中，如此二倍稀释法至第6管，再从第6管吸出0.5亳升弃去，第7管不加血清，作为对照，此时血清稀释倍数为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶640。（实验图4－3）（5）将第二排同样方法稀释。见实验图4－3。（6）用5亳升吸管吸取伤寒杆菌“O”菌液，加入第一排各管中，每管0.5亳升（由最后一管依次向前加入）。此时血清以被稀释一倍。（7）另取一支5亳升吸管吸取伤寒杆菌“H”菌液，同样方法另入第二排各管中，每管0.5亳升。（8）用手摇管架数次，使各管液体混匀，放56℃水浴箱中2小时或37℃温箱中过夜，观察结果。

实验图4－3

血清对倍稀释示意图

3.观察结果时注意（1）自水浴箱中取出后，切忌摇动试管。先观察盐水对照管，管底沉淀物呈圆形，边缘整齐，轻轻振摇，细菌分散仍呈混浊现象。（2）试管应由第一管看起。如有凝集，可见管底有沉淀凝集块，边缘不整齐，液体上部澄清。“O”菌液的凝集呈颗粒状，不易摇碎。“H”菌液的凝集呈棉絮状，轻摇即升起。（3）凝集强弱，判定以“+”号表示如下： “++++”——很强，细菌全部凝集，菌液澄清，轻摇有大片凝集块。 “+++”——强，细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊，凝集块较小。 “++”——中等强度，细菌部分凝集于管底，液体半澄清，凝集块小。 “+”——弱，细菌仅少量凝集，液体混浊。 “––”不凝集，液体混浊与对照管相似。（4）凝集效价的判定：血清的最高稀释倍数呈明显凝集（++）者，为该血清的凝集效价，用稀释倍数表示之。

（三）早孕检测1.方法取HCG金标试纸条（早孕试验试剂）3条，分别将白色一端插入阳性对照、阴性对照、待检尿液中，使用时尿液面不超过Max线，5s后取出平放，3min内观察结果。2.结果判断出现1条红线者为阴性，出现2条红线者为阳性；如无红线出现，表明试纸条失效。早早孕试验阳性说明孕妇尿中含有绒毛膜促性腺激素（HCG）；阴性则说明尿中无HCG。

3.原理

斑点金免疫层析试验（DICA）又称一步金法，它以硝酸纤维膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，使膜条测试端的待测尿液慢慢向另一端渗移，在移动中，待测尿液内的HCG（抗原）与膜上包被的金标抗HCG结合，形成抗原抗体复合物，从而出现阳性反应现象（实验图4－4）

（四）ELISA双抗体夹心法（示教）

1.原理以ELISA双抗体法测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）。用抗HBs包被反应孔，加待测标本，若其中有HBsAg，则与反应板孔上的抗HBs结合，再加入酶标抗HBs，加底物与色原显色。颜色深浅与HBsAg含量成正比。（实验原理见教材免疫学应用三、免疫诊断的图4－6）。

2.实验步骤(1)包被：反应板已经包被已知抗体。(2)加样：加一定浓度稀释的待检样品(同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照)0.1ml于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃，1h。用洗涤缓冲液洗板6次，每次3min。(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃，0.5～1h，用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。(4)加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB底物溶液0.1ml，37℃，10-30min。(5)终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05ml。(6)结果：用肉眼观察阳性对照血清显色，阴性对照血清无色；被检血清显色为阳性，无色为阴性。

四、常用生物制品观察（示教）生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。生物制品种类：用于预防的有活疫苗、死疫苗、联合疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗、类毒素等；用于治疗的有抗毒素、抗病毒血清、丙种球蛋白等；用于诊断的有诊断血清和诊断抗原。

【实验报告】1.列表比较免疫器官的功能。2.绘图吞噬细胞的吞噬现象。3.分析豚鼠过敏性休克的结果。4.简述玻片凝集反应的方法。5.判定试管凝集的效价，分析其结果。6.列出实验室陈列的生物制品的用途。

实验五病原微生物（示教）【实验目的】1.掌握：常见的病原微生物的形态2.熟悉：常见细菌、真菌培养物的形态；抗链球菌溶血毒素“O”试验的临床意义3.了解：厌氧培养法、血浆凝固酶试验、抗酸染色法的用途；肥达氏试验的临床意义

【实验内容及方法】一、镜下观察病原微生物的形态二、观察常见细菌、真菌培养物的形态特点三、血浆凝固酶试验四、抗酸染色法五、抗链球菌溶血毒素“O”试验六、肥达氏试验

一、镜下观察病原微生物的形态葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、结核分支杆菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽胞杆菌、破伤风梭菌、狂犬病毒包涵体、支原体、衣原体、立克次体、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、皮肤丝状菌、白色念珠菌。

二、观察常见细菌、真菌培养物的形态特点 （一）细菌在血平皿培养物上的观察

葡萄球菌（金葡、白葡）菌落的形态大小、色素、溶血环；链球菌（甲链、乙链）的菌落形态大小、溶血环。

（二）真菌培养物的观察

真菌菌落在形态上可分三大类：1、酵母型菌落：外观似白色葡萄球菌菌落，湿润柔软、圆形、表面光滑。新型隐球菌等属此型。2、类酵母型菌落：外形似酵母型菌落，不同之处是该型菌落生长假菌丝伸入培养基内。白色念珠菌属此型。3、丝状菌落：菌落表面似绒毛状、粉末状或棉花样，一部分向空中生长（称空中菌丝），一部分菌丝伸入培养基内（称营养菌丝），且能产生各种色素。皮肤丝状菌等属这类菌落。

（三）厌氧培养法介绍 厌氧培养的方法很多，可分为生物法、物理法和化学法。下面只介绍生物法中的肉渣培养法。1．生物法----肉渣培养法 肉渣培养基的制作

成份：牛肉渣、牛肉浸液（牛肉膏）。

制法：将做牛肉浸液的牛肉渣，装入试管，高约3毫米，加入牛肉浸液或牛肉膏汤（PH7．6）约5毫升，比肉渣高一倍。121℃高压灭菌20-30min后保存于冰箱内备用。

用途：用于厌氧菌培养。

注意：如无肉渣也可用牛、羊血等代替，将血块先放入水内煮沸，取出成小块，血块在加热后摇匀成碎颗粒状。

方法：以无菌操作方法，将检查物接种于肉渣管内。液面上加入已溶解的凡士林，高约0．5厘米，封闭液面，隔绝空气，造成厌氧环境。37℃培养18～24h后观察结果。2．物理法----抽气换气法3．化学法----焦性没食子酸法、硫乙醇酸钠法、厌氧罐法、厌氧袋法等方法

三、血浆凝固酶试验

多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，此酶能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的兔或人血浆发生凝固。在一般情况下，非致病性葡萄球菌不产生此酶。因此，是否产生凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。

方法：1.用毛细吸管把已稀释的兔血浆分别加入金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的肉汤培养物中，每管加0.5毫升。2.轻轻摇动试管，使之混匀。3.将试验管放入37℃水浴箱中，60min后观察结果。凡血浆呈现冻胶样凝固者，为血浆凝固酶阳性；若仍为液状，则为阴性。

四、抗酸染色法

（一）方法1.取病人痰液涂片一张，在火焰外焰上固定。2.用长木夹夹住标本片的一端，然后加石炭酸复红液数滴，使染色液覆盖全部的痰液涂片处。将加了染色液的涂片置酒精灯火焰上方微微加温，直到染液冒出蒸汽，维持5分钟（切勿煮沸或煮干），若染液因加温而减少则可适当补充。（或加温到染液冒出蒸汽即置台上5分钟亦可。）3.冷却后，用自来水洗去多余的染料，此时标本片呈红色。4.用3%盐酸酒精脱色，将3%盐酸酒精滴加于涂片上，轻轻晃动玻片，然后倾斜玻片，使酒精流尽，再次滴3%盐酸酒精，晃动玻片，直至无红色颜料脱下为止，水冲洗。5.加碱性美蓝液复染1分钟，水洗，自干或用吸水纸吸干，油镜检查。

（二）结果抗酸性细菌（如结核杆菌）因不被盐酸酒精脱色，呈红色；非抗酸性细菌和细胞等因被盐酸酒精脱色，则复染呈蓝色。将观察结果绘图。

五、抗链球菌溶血毒素“O”试验

大多数对人类致病的A族溶血性链球菌都能产生溶血毒素“O”。溶血毒素“O”有溶解红细胞、杀害白细胞及毒害心脏的作用。此外，溶血毒素“O”有抗原性，能刺激机体产生相应的抗体，即抗链球菌溶血毒素O（ASO）。血清中ASO的测定可用于溶血性链球菌感染的诊断。ASO高滴度的病人血清被适量的溶血素中和后还有ASO多余，这些多余的抗体即与ASO胶乳试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒。

（一）材料 1.溶血素“O”溶液，摇匀后使用 2.ASO胶乳试剂，摇匀后使用 3.阳性控制血清 4.阴性控制血清

（二）方法 定性检测1.血清标本用生理盐水1:50稀释，56℃灭活30min。2.在反应板各方格上分别滴加稀释灭活血清以及阳性和阴性控制血清一滴，再各滴加溶血素“O”溶液一滴。轻轻摇动3分钟，使其充分反应，并均匀分布于方格内。3.在各方格内滴加ASO胶乳试剂一滴，于室温为20℃的环境下轻轻摇动8min，将反应板平放在实验桌上，在自然光线下有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。4.阳性的1:50稀释血清，进一步稀释为1:80，再重复步骤2和3，有明显凝集者为强阳性。

半定量检测

1.待检血清用生理盐水倍比稀释（方法如下表）：管号123稀释倍数1:21:41:8生理盐水100µl100µl100µl待检血清100µl100µl100µl检测标本量50µl50µl50µl待检血清中4008001600ASO的含量 2.取不同稀释倍数的待检血清各50µl进行检测（操作方法同定性检测），阳性者即可从上表中查出待检血清中ASO的含量。

（三）注意事项1.本试剂为定性的ASO胶乳，决非半定量试剂。在血清作适当稀释后，出现血清稀释度和ASO滴度间的关系大致如下： 稀释度 ASO滴度 1:50 ≥500 1:80 ≥800 1:100 ≥10002.ASO胶乳加入后，轻轻摇动到本说明指定的时间，应立刻记录结果。放置一段时间后再出现的清晰凝集不列为阳性。阳性控制血清应在本说明指定的时间内出现清晰凝集。但不能将阳性控制血清出现凝集的时间为判断结果的时间界限。3.溶血，脂血，高胆红素血症，高胆固醇血症，类风湿因子阳性都不会影响本试验结果。4.胶乳试剂不可冰冻，放置在4℃冰箱保存、有效期为一年，用前应该摇匀。5.室温降低10℃，在胶乳试剂加入后应延长反应时间2min，室温升高10℃，应缩短反应时间2min。6.本试验用的滴管口径及装胶乳试剂的塑料瓶的口径应同样大小，保证滴液大小一致。

六、肥达氏试验 本实验是根据凝集反应原理，用已知的伤寒杆菌鞭毛抗原（H）及菌体抗原（O）、甲型、乙型（肖氏）副伤寒杆菌鞭毛抗原（H）和病人血清作定量凝集试验，用于检查伤寒、副伤寒抗体及其含量，作为诊断伤寒、副伤寒的参考依据。

（一）材料 1.病人血清 2.诊断菌液：伤寒杆菌“H”、“O”抗原 3.甲型、乙型（肖氏）副伤寒杆菌鞭毛抗原（H） 4.生理盐水 5.试管、吸管、试管架、52℃水浴箱等

（二）方法 1.稀释病人血清

（1）试管架上放置四排试管，每排6支，以吸管吸取生理盐水，每管加入0.5ml。 （2）以1毫升吸管吸取病人血清（1:20），于每排的第一管各加入0.5毫升，然后混匀（吸吹各3次），使病人血清稀释成1:40。 （3）按顺序，进行血清的一系列稀释：即自每排的第一管吸取0.5ml（1:40）稀释血清加入第2管中，充分混匀后，再自每排的第2管吸取0.5ml加入第3管，依此顺序稀释至第5管，混匀后，自每排的第5管吸出0.5ml弃去（放置盛有消毒液的缸内）每排的第6管不加病人血清，以作对照。

2.加抗原

第一排，各管加伤寒“H”诊断菌液3滴； 第二排，各管加伤寒“O”诊断菌液3滴； 第三排，各管加副伤寒“甲”诊断菌液3滴； 第四排，各管加副伤寒“乙”诊断菌液3滴。 3.加完诊断菌液后充分摇匀，置52℃水浴箱中，约1:30h后或是37℃24h看结果。

4.观察和记录结果

（1）先观察对照组：管内液体均匀混浊。或久置后可见管底沉淀物呈圆形小团，边缘整齐，若轻轻摇动试管，细菌则再分散于盐水中而恢复均匀浑浊，即为不凝集。 （2）观察试验管：第1～5管为试验管，如有凝集，管底出现凝块并呈帽状贴于管底，边缘不整齐，液体澄清或较澄清。若轻轻摇动试管，“H”凝集者凝块呈棉絮状悬于盐水中，易散；“O”凝集者凝块呈紧密的颗粒，不易散。 （3）以如下符号作记录： ++++液体清亮，细菌完全被凝集于管底。 +++液体轻度混浊，细菌大部分被凝集于管底。 ++液体中等混浊，约有50%细菌被凝集于管底。 +液体很混浊，少量细菌凝集于管底。 －与对照管相同，液体混浊，管底无凝集，但有细菌沉淀的小圆团。血清效价（滴度）：以呈现明显凝集（++）的血清最高稀释度表示。

5.报告方式

（1）报告O、H血清效价。 （2）血清最低稀释倍数仍无凝集现象的报告阴性。 （3）如第6管的血清最高稀释倍数时仍在++以上者，应报告高于1：2560。 （4）正常值：伤寒“H”(TH)<1：160、伤寒“O”(TO)<1：80、甲型副伤寒(PA)<1：80、乙型副伤寒(PB)<1：80、丙型副伤寒(PC)<1：80。（5）临床意义：辅助诊断伤寒、副伤寒。

【实验作业】 1.绘出下列微生物的镜下形态葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、结核分支杆菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽胞杆菌、破伤风梭菌、狂犬病毒包涵体、支原体、衣原体、立克次体、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、皮肤丝状菌、白色念珠菌。 2.简述抗酸染色的方法。 3.抗链球菌溶血毒素“O”试验有何意义？ 4.判断肥达氏试验的效价，分析其结果。

实验六医学蠕虫（示教）【实验目的】1.掌握：常见医学蠕虫的成虫和虫卵的形态特征2.熟悉：蠕虫中间宿主和感染阶段；粪便寄生虫卵检查；肛门拭子法3.了解：蠕虫其它结构形态

【实验内容及方法】一、肉眼观察蠕虫成虫大体标本形态二、镜下虫卵形态观察三、镜下蠕虫其它结构形态观察四、蠕虫中间宿主、感染阶段的观察五、粪便寄生虫卵检查六、肛门拭子法（示教）

一、肉眼观察蠕虫成虫大体标本形态

蛔虫、钩虫、蛲虫、鞭虫、肝吸虫、姜片虫、卫氏并殖吸虫、日本血吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫。注意其前后端、雌雄、形态、颜色、大小、吸盘、睾丸特点、节片形态及注意线虫、吸虫及绦虫之间的区别。

二.镜下虫卵形态观察

蛔虫卵（受精、未受精）、钩虫卵、鞭虫卵、蛲虫卵、肝吸虫卵、姜片虫卵、卫氏并殖吸虫卵、日本血吸虫卵、带绦虫卵、链状（猪）带绦虫、肥胖（牛）带绦虫头节。注意虫卵的大小、形态、颜色、卵壳及卵内构造。

三、镜下蠕虫其它结构形态观察

钩虫口囊（十二指肠钩虫、美洲钩虫）、蛲虫食管球、（班氏、马来）微丝蚴、旋毛虫幼虫囊包，注意囊包长轴与肌肉纤维平行；日本血吸虫毛蚴、尾蚴；链状带绦虫、肥胖带绦虫头节、孕节（子宫分支）

四、蠕虫中间宿主、感染阶段的观察

肝吸虫——豆螺、沼螺、淡水鱼虾、囊蚴；姜片虫——扁卷螺、荸荠、菱角、茭白、囊蚴；肺吸虫——川卷螺、溪蟹、蝲蛄、囊蚴；血吸虫——钉螺、尾蚴；链状带绦虫囊尾蚴（米猪肉）大体标本

五、粪便寄生虫卵检查 （一）粪便直接涂片法（示教）

粪便检查是诊断寄生虫病常用的方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24h。盛粪便的容器要干净，并防止污染与干燥；粪便不可混杂尿液等，以免影响检查结果。

方法：取清洁玻片1张，中央滴加生理盐水1～2滴，用竹签挑取少许新鲜粪便于生理盐水中涂匀成薄膜，直径约1cm，厚度以透过粪膜涂片刚可辨认字迹为宜。先用低倍镜观察，必要时换高倍镜检查，但需加盖玻片，以免污染镜头。

（二）饱和盐水浮聚法（示教）

利用饱和盐水的比重（1.17～1.18）大于某些虫卵（主要是线虫卵）比重的特点，使粪便中的虫卵浮聚于饱和盐水液面，可达到集卵的目的，提高检出率。此法用于检查钩虫卵效果最好，也可用于检查其他线虫卵和微小膜壳绦虫卵。但不适用于检查吸虫卵和原虫包囊。 方法：用竹签取黄豆粒大小的粪便置于浮聚瓶（高3.5cm，直径约2cm的圆形直筒瓶）中，加入少量饱和盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口，但不溢出为止。此时在瓶口覆盖一载玻片，静置15分钟后，将载玻片提起并迅速翻转，镜检。 饱和盐水配制：将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止。

（三）沉淀法（示教）

利用虫卵比重比水大的特点检查虫卵。有自然沉淀法、倒置沉淀法、离心沉淀法等，阳性率高。

六、肛门拭子法（示教）适用于在肛周产卵的蛲虫，或常在肛门周围带绦虫卵的检查。现在常用透明胶纸法：用长约6cm，宽约2cm的透明胶纸粘擦肛门周围的皮肤，取下胶纸，将有胶面平贴玻片上，镜检。操作者应当在取材后立即消毒洗手，以防蛲虫卵感染

【实验作业】1.绘出蛔虫受精卵、蛔虫未受