植物生物技术 第五-八章学习资料

第五章单倍体培养1.概念：花粉的二型性在花药/花粉培养时，由于对培养条件的反应不同，花粉在形态上形成两种类型，一类是具胚性的，在烟草和大麦中，花粉小，染色浅；另一类为花粉大，染色深，朝成熟花粉方向发展2.单倍体在遗传和育种中的应用价值（一）、缩短育种周期（二）、提高目标基因型的选择效率如果某一性状受一对基因控制AA×aa→F1→F2中纯合AA个体只有1/4F1采用花药或花粉培养，产生的后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提高一倍如属两对基因控制AAbb×aaBB,F2中要选出AABB个体的机率只有1/16F1采用花药或花粉培养，AaBb只产生4种花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB个体的频率可达1/4比常规杂交育种效率提高4倍常规育种：单倍体育种=1/22n：1/2n。（三）、排除杂种优势对后代选择的干扰对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差采用DH群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异（四）、遗传研究的良好实验材料体系单倍体在作物的数量遗传研究中可能有较大用途，如：基因相互作用的检测、遗传变异的估计、连锁群的检测、影响数量性状的基因数目的估计及多基因的定位等DH系是分子标记遗传作图的良好群体单倍体可用来创造非整倍体材料，用单倍体与二倍体杂交，可创造一系列的附加系，从而研究染色体的遗传功能花药和花粉培养体系还是发育遗传研究的良好材料，可以用来研究细胞的分裂及分化，研究花粉发育途径的转变，以及与转变有关的基因的表达与调控（五）、突变体的筛选单倍体的每个基因都是单拷贝的，各种隐性基因都可以表现出来，加倍后形成的双单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率对花药进行离子照射，然后对花药愈伤筛选，可以获得理想的突变体（六）、消除致死基因单倍体带有致死基因的个体即使加倍后形成双单倍体也会由于基因的纯合而被消除，而致死基因在自然群体里常常因为杂合体的存在而不易被彻底消除。（七）、选育新型自交系对双亲或多亲杂交的杂种一代进行花药或花粉培养，获得的双单倍体实际上是纯合的自交系，在杂种优势利用育种中有很大用途（八）、遗传转化的受体材料在转基因育种中，如果用体细胞为受体，经常遇到转基因后代材料分离问题，经多代选择才能稳定下来如用单倍体细胞作受体，获得的转基因材料经加倍后，从理论上讲会很快达到纯合状态受体材料可以是花粉、单倍体原生质体、单倍体胚或单倍体植株作外植体培养条件下小孢子的发育途径花粉培养与花药培养的优势体现在哪些方面3.玉米种群中存在高产不抗病（AAbb）、低产抗病(aaBB)两种类型，以此为材料，采用何种技术路线培育高产抗病新品种，绘出技术路线图。第六章原生质体培养1.原生质体的概念：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞2.原生质体培养的应用：（1）种质资源保存；（2）原生质体融合，克服生殖障碍；（3）筛选突变体；（4）遗传转化a.同一组织可产生大量遗传上基本一致的原生质体,b.如具有再生能力，易获得转化植株,c.易摄取外源遗传物质,d.转化后固体包埋培养，可避免嵌合体的发生基础研究；（5）细胞壁的发生过程、膜的结构等的研究3.原生质体分离方法：（1）机械分离法：机械法分离质壁分离细胞缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力（2）酶法分离：A优点.a可在短时间内获得大量原生质体，b.分为直接法和顺序法两种；B缺点.不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用影响原生质体分离的因素（酶法）(1)从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体(2)但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响(3)原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。4.常用于原生质体分离的材料（原料）：叶片：易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片愈伤组织及悬浮系：避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒注意：选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体用来分离植物原生质体的酶制剂：纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶离析酶（果胶酶）纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外5.原生质体的纯化方法：离心沉淀法：原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸取上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀，如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。漂浮法：原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：离心。第三步：取上清液，洗涤液重悬，离心。2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。界面法：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。6.原生质体活力的测定：形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。染色识别：（1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。（2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。FAD:荧光素双醋酸酯（Fluoresceindiacetate），常用丙酮配置成2mg/ml溶液，在冰箱（4C）中保存FDA本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，而在细胞中积累。在紫外光照射下，发出绿色荧光相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光7.原生质体培养方法各方法的特点：(1)液体浅层培养:特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相。操作简单，可微量培养。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。(2)平板法培养:原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿（2-3mm）中。特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位跟踪观察。但是原生质体释放的有毒物质不易扩散。（3）双层培养法：培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。（4）饲喂层培养：方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。第七章植物原生质体融合1.原生质体融合的方法及特点：无机盐诱导融合；聚乙二醇、高pH高钙诱导融合；电融合技术。（1）无机盐诱导融合NaNO3作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高，约1%。1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。（2）聚乙二醇：PEG桥梁,使原生质体凝聚——PEG被洗脱——导致质膜表面电荷重排，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合——膜接触——融合优点：融合频率高；可重复性强；毒性较低；诱发融合无特异性（植物+植物，植物+动物，动物+酵母）不足：PEG处理后线粒体变形；融合产物粘在融合器皿上；培养时融合体分裂频率不高（3）高pH高钙诱导融合：高钙促进原生质体结合，高PH可以改变质膜表面的电荷性质，有利于融合。优点：杂种产量高，达到20-50%。不足：高pH值对细胞有毒害作用。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。（4）电融合技术：原理：交流电场使原生质体表面电荷偶极化；原生质体沿着电极排列，形成串珠；施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，最后形成融合的原生质体。Senda1979年首先用此方法实现原生质体融合电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分融合过程：原生质体接触质膜融合——圆球化——核融合优点：无化学毒性，对细胞伤害小；融合效率高；重复性强；融合技术操作简便；电参数容易精确调节2.原生质体融合的方式，供体的处理，受体的处理。（1）对称融合：是亲本原生质体在融合前未进行任何处理（如辐射、碘乙酰胺等）的一种融合方式。优缺点但由于它综合双亲的全部性状，在导入有利性状的同时，也不可避免地带入了一些不利性状（2）非对称融合：在融合前，对一方原生质体进行射线照射处理，以钝化其细胞核（供体，Donor），另一方原生质体（受体，Recipient）不处理或经化学试剂（如碘乙酰胺、碘乙酸、罗丹明6-G等）处理，所以也称供-受体融合A、供体处理：造成染色体的断裂和片段化，从而使供体染色体进入到受体后部分或全部丢失，达到转移部分遗传物质或只转移细胞质的目的，处理方法：射线（X、γ和UV）辐射原生质体；限制性内切酶处理原生质体；纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体B、受体处理：为了减少融合再生后代的筛选工作，利用一些代谢抑制剂（Metabolisminhibitor）处理受体原生质体以抑制其分裂常用的抑制剂：碘乙酸（Iodoaceticacid，IA）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IOA）和罗丹明6-G（Rhodamin6-G，R-6-G）【受IA、R-6-G和IOA处理的细胞和未受代谢抑制剂处理的细胞发生融合后，代谢上就会得到互补，从而能够正常地生长】非对称融合方式：“供体-受体”系统；“胞质体-原生质体”融合；“小原生质体-原生质体”融合3.杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种细胞法；双荧光标记选择法（1）互补选择法：原理，利用2个亲本对培养基、抗代谢物、或温度等的敏感性存在着天然的互补性进行选择叫互补法选择。也可以利用隐性基因的互补性进行选择。分类：A、激素自养型筛选；粉蓝烟草和郎氏烟草的野生型叶肉细胞原生质体是激素异养型细胞，原生质体不分裂；杂种细胞是激素自养型细胞，且在没有激素的培养基上可以旺盛分裂；使融合产物在不含激素的培养基上培养，能够产生细胞团的就是融合的原生质体B、营养缺陷型突变互补；硝酸还原酶的蛋白突变体和辅因子突变体，突变体不能利用硝态氮，只能利用铵态氮。两者的突变位点不同，原生质体融合后，硝酸还原酶恢复，可以利用硝态氮C、利用对抗代谢物质的敏感性互补进行筛选(2)机械分离杂种细胞法:原理，利用叶肉细胞和培养细胞原生质体的天然色泽标记进行选择。方法：混合物培养3-5天后，在显微镜下用微吸管将融合产物（4-8个细胞的细胞团）转移，进行微室培养。（3）双荧光标记选择法：异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色/异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色4.杂种植株的鉴定：（1）形态学鉴定；（2）细胞学鉴定；（3）分子标记鉴定；（4）荧光原位杂交技术；（5）蛋白质分析（1）形态学鉴定：杂种在形态上往往介于双亲之间，包括株型、叶形、花器官等（2）细胞学鉴定；染色体观察：染色体数目是双亲之和，或少1至几条染色体；细胞融合可以创造非整倍体、代换系、染色体片段置换系等材料流式细胞仪倍性分析：利用细胞倍性检测仪可以粗略地分析杂种细胞的倍性，一般与双亲对照分析，测出的杂种的DNA含量基本是双亲之和。（3）分子标记鉴定：最有效的检测手段，能检测出遗传物质的细小重组（4）荧光原位杂交技术：鉴定异源染色体的重组情况，将重组片段定位在染色体上。（5）蛋白质分析：蛋白质电泳分析：从基因表达产物判断真假杂种，一般应有双亲作对照，可以对多种蛋白作分析第八章植物基因克隆的原理与技术1.概念：（1）同尾酶（2）同裂（工）酶（1）同尾酶：来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割（2）同裂（工）酶：指来源不同，但识别相同靶序列的核酸内切酶同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同2.了解各种载体的结构、特点与容量，掌握载体的选择载体特点：能自主复制；易于分离和纯化；含有可供选择的遗传标记；含有一个或多个多克隆位点（multipleclonesites,MCS）；不含与复制无关的区域；不影响宿主的生长和繁殖常用的载体：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC（细菌人工染色体），YAC（酵母人工染色体）载体名称受体细胞结构插入片段容量举例质粒E.coli环状〈8kbpUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBACE.coli环状≈300kbPeloBAC系列YAC酵母细胞线性染色体100-2000kb（1）质粒载体的一般生物学特性:①质粒DNA的构型：SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型性DNA（cDNA）②不同质粒的分子量大小差异相当显著：106～108D③质粒DNA的复制类型：a.低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒b.高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒④质粒DNA的接合性：接合是细菌通过性菌毛相互牵引，然后遗传物质（主要是质粒DNA）通过胞质通道从供体菌转移给受体菌，使受体菌获得的新的稳定遗传性状的现象。接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。与两类基因有关：tra基因、mob基因和bom位点.⑤质粒的不亲合性：在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。质粒的不亲合性分子基础：主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰。经典质粒载体：pBR322和pUC系列（pUC8/9）结构：pBR322①复制起点ori②Ampr基因③Tetr基因pUC系列（pUC8/9）①复制起点②Ampr基因③lacZ的启动子④lacZ’基因pUC特点①更小的分子量②选择方便③克隆便利（2）λ噬菌体载体：一种可在体外包装的细菌病毒，可高效感染大肠杆菌。基因组DNA呈线性，其两端的5’末端带有12个碱基的互补单链（粘性末端，cos位点）①噬菌体头部合成基因,编码A-F,W7种不同的蛋白质(左侧)。②噬菌体的尾部合成基因,编码10种不同的蛋白质基因(包括J)。③与λ噬菌体的整合、重组等有关的基因(中部)。④与λ噬菌体的表达调控有关的基因右半部分(包括N)。⑤其它与λ噬菌体的DNA合成有关的基因分类：插入型载体，有一位点供外源DNA插入,如凯伦(Charon-40)粒,切点位于－半乳糖苷酶基因内,长35kb,可容9.4~24.2kb,可供克隆小片段DNA和构建基因文库取代型载体，中央部分有一个可被外源DNA取代的DNA片段，如GEM11/12,可容24kb,可供构建基因文库（3）粘粒：是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体，它含COS序列，插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端。全长8kb。可包装30-45kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。优点：.具有噬菌体的特性（cos位点）：被包装后能高效转化E.coli.具有质粒载体的特性：自主复制，带有抗性标记，易于选择阳性克隆.高容量的克隆能力：可载高达45kb外源DNA.因不含的基因，故不会裂解.便于定向克隆（4）YAC酵母人工染色体：含有酵母染色体端粒、着丝点及复制起点等功能序列，YAC是迄今容量最大的克隆载体，插入片段平均长度在200－1000Kb，最大可达2Mb主要缺点．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构．操作时容易发生染色体机械切割.转化效率低BAC细菌人工染色体：四个功能区：①与BAC复制和分裂有关的基因，parA，parB是分裂所必需的基因，parB与质粒的不相容性有关②复制起点及相关的元件，oriS是单向复制子；repE基因编码oriS复制所必需的蛋白质Ｅ③抗生素标记基因，载体上携带的抗生素标记基因为氯霉素抗性基因，是载体的筛选标记用途：能携带约300kb的DNA片段；用于基因组文库的构建；物理图谱构建；基因的图位克隆BAC的优点：1．易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）2．超螺旋环状载体，易于操作3．F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制4．很少发生体内重排3.掌握基因分离的方法（1）以已知序列为基础的基因克隆方法：以氨基酸序列为基础，根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，以RT-PCR产物为探针或者进行RACE-PCR扩增的方法克隆基因的全长以核苷酸序列为探针：快速扩增cDNA末端——5’端RACE、3’端RACE——mRNA反转录为一链的cDNA——利用5’cDNA的帽子结构设计出的引物分别与基因的特殊引物进行PCR嵌套扩增获得一条或者几条特异的PCR带型——分别将这些带型克隆到质粒载体上进行PCR测序，通过分析和比较以后就可以获得待克隆基因的5’端的片段（2）以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法：图位克隆a.先将目的基因定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连接的分子标记（RFLP）b.利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因组片段克隆并分离出来C.根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆重鉴定出目的基因(3)以人工突变体为基础的基因克隆方法T-DNA插入突变体分离克隆基因的步骤T-DNAvectors——转化植物（hemizygousforT-DNAT1)收获T2种子——筛选T2，获突变子，应为3：1分离——确定