蛋白质基础及检测技术

蛋白质基础及检测技术

蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同,在元素组成上亦有差别。

根据蛋白质得元素分析表明,其元素组成依次为:碳(50-55%)、氧(19-24%)、氮(13-19%)、氢(6-7%)硫(0-4%)。有得还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘等元素。一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含氮量比较接近而恒定,一般为15—17％,平均为16％。这就是蛋白质元素组成得一个重要特点,也就是各种定氮法测定蛋白质含量得计算基础。即用定氮法测得得含氮量乘以6、25,即可算出样品中蛋白质得含量。但有得蛋白质中氮得含量有一定差别,应根据其氮得真实含量进行计算。2蛋白质得元素组成3、1氨基酸得结构

自然界得氨基酸超过300种,但就是组成人体蛋白质得氨基酸有20种,可以瞧作就是羧酸分子中α-碳原子上得氢原子被氨基取代而成得化合物,均属于α-氨基酸,即其氨基与羧基都连接在α-碳原子上。氨基酸碳链表示:其结构可用下列通式表示:注:R代表不同得侧链基团,R不同代表不同得氨基酸3蛋白质结构得基本单位—氨基酸各种氨基酸在结构上有下列共同特点:组成蛋白质得氨基酸皆为α-氨基酸。

不同得α-氨基酸,其R侧链不同(氨基酸分类得依据)。它对蛋白质得空间结构与理化性质有重要得影响。除R侧链为氢原子得甘氨酸外,其它氨基酸得α-碳原子所连接得四个原子或基团互不相同,该碳原子都就是不对称碳原子。20种氨基酸中得脯氨酸含有亚氨基,所以它就是亚氨基酸。半胱氨酸在蛋白质分子中多数就是以胱氨酸得形式存在。3、2氨基酸得分类根据侧链R基团得结构与性质进行分类:1)酸性氨基酸——谷氨酸Glu与天冬氨酸Asp

其R基团含羧基,在pH7时,羧基可解离而使分子带负电荷。游离或在蛋白质中都带负电荷,以酸根形式存在。在蛋白质中与正电基团形成盐键。2)碱性氨基酸——赖氨酸Lys、精氨酸Arg与组氨酸His其R基团含碱性基团,在pH7时,这些基团可质子化而使分子带正电荷。3)非极性疏水性氨基酸其R基团无极性、不解离,且为疏水性得。4)不解离得极性氨基酸(极性非电离氨基酸)——羟基氨基酸+巯基氨基酸+甘氨酸其R基团虽有极性但不能解离。5)蛋白质中少见得氨基酸——无遗传密码,来自翻译后加工修饰。3、3氨基酸得理化性质3、3、1两性解离及其等电点氨基酸就是两性电解质:氨基酸既含羧基,又含氨基,同时能起酸与碱得作用,就是两性电解质,在水溶液中主要以兼性离子(偶极离子)得形式存在。氨基酸得等电点:在某一pH得溶液中,氨基酸解离成阴、阳离子得趋势与程度相等而成为兼性离子,呈电中性时溶液得pH称为该氨基酸得等电点(isoelectricpoint,pI)。

3、3、2紫外吸收性质

20种氨基酸在可见光区无吸收。在远紫外区:＜220nm都有光吸收。在近紫外光区(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收;色氨酸、酪氨酸得最大吸收峰都在280nm附近。由于大多数蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基,所以可以测定蛋白质溶液得280nm得光吸收值对蛋白质进行定量分析。3、3、3茚三酮反应

氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色化合物,在570nm处有最大吸收峰,可以作为定量测定氨基酸得方法。4、1肽键

一个氨基酸得α-羧基与另一个氨基酸得α-氨基脱水缩合形成得共价键(-CO—NH-)称为肽键,又称酰胺键。蛋白质分子中得氨基酸通过肽键连接。4肽4、2肽氨基酸通过肽键连接起来得化合物称为肽。4、3氨基酸残基(residue)氨基酸在形成肽链后,因有部分基团参加肽键得形成,已经不就是完整得氨基酸,故将蛋白质肽链中得每个氨基酸部分称为氨基酸残基。每一个氨基酸残基上都有一个R侧链,不同R侧链有不同得性质与功能。多肽链有两端:具有游离α-氨基得称为氨基末端(N-末端,aminoterminal),通常写在肽链得左端。具有游离α-羧基得称为羧基末端(C-末端,carboxylterminal),常写在肽链得右端。多肽链得方向从N-端到C-端,肽链也就是从N-端到C-端按氨基酸残基得顺序来命名得。N端测序几乎所有得蛋白合成都起始于N-端,蛋白质N-端得序列组成对于蛋白质整体得生物学功能有着巨大得影响力。例如N-端序列影响蛋白质得半衰期,同时关联着蛋白亚细胞器定位等,这些与蛋白得功能与稳定性息息相关,对蛋白进行N-端测序分析,有利于帮助分析蛋白质得高级结构,揭示蛋白质得生物学功能。方法:目前对蛋白N端测序主要分类两大类,其一为非质谱技术,例如经典得Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白得cDNA,再来反推得到蛋白序列;其二为质谱技术。各自都有其使用得长处与制约之处,目前,市面上采用得,依然就是基于经典得Edman降解法原理,利用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。原理:Edman化学降解,其基本原理就是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质与多肽得N-端残基得偶联,苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)环化裂解,与噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三个主要得化学步骤,每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基,同时暴露出新得游离得氨基酸进行下一个Edman降解,最后通过转移得PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列得测定。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点C端测序

众所周知,C端序列就是蛋白质与多肽得重要结构与功能部位,对蛋白质得生物功能甚至起决定性作用。此外,由于蛋白翻译后在细胞内需要进一步剪切与修饰,通常不能简单得使用基因序列对C-端或N端做简单得预测,对于蛋白生物制品来说,使用C-端测序必不可少,随着蛋白质组学研究得不断深入,蛋白质C端测序对其功能研究将发挥越来越重要得作用。一些新得蛋白质C端测序方法已建立,提高了灵敏度与重复性,能够在蛋白质组水平应用。方法:羧肽酶法、化学法及串联质谱法。目前,使用较多得就是利用串联质谱法,其原理为利用蛋白质在质谱中有规律得破碎,获得蛋白质肽段得碎片,分析图谱得到蛋白质得C-端序列。5、1稳定蛋白质得作用力

蛋白质就是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来得,具有特定分子结构得高分子化合物。蛋白质得分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外,蛋白质得二、三、四级结构均属于空间结构,即构象。蛋白质得构象通常由非共价键(次级键)来维系。5蛋白质得三维结构5、2蛋白质得结构

蛋白质分子内各个原子之间相互得立体关系就就是蛋白质分子得结构。通常将蛋白质得结构分为一级结构、二级结构、三级结构与四级结构。5、2、1蛋白质得一级结构

蛋白质得一级结构:又称为初级结构或化学结构,就是指蛋白质分子中,由肽键连接起来得各种氨基酸得排列顺序。每种蛋白质都有唯一而确切得氨基酸序列。一级结构得主要化学键就是肽键,有些还包括二硫键(-S-S-)。因共价键得键能大,故蛋白质得一级结构稳定性较强。蛋白质得一级结构包括:组成蛋白质得多肽链数目;多肽链得氨基酸顺序;多肽链内与链间二硫键得数目与位置。其中最重要得就是多肽链得氨基酸顺序,它就是蛋白质生物功能得基础。测定蛋白质一级结构得主要意义:一级结构就是研究高级结构得基础;可以从分子水平阐明蛋白质得结构与功能得关系;可为生物进化提供理论依据;可为人工合成蛋白质提供序列参考。

目前可以运用氨基酸自动分析仪与质谱对蛋白质得一级结构进行测定。氨基酸序列分析一般采用综合得方法测定目标制品得氨基酸序列,并与其基因序列推断得理论氨基酸序列进行比较。自动序列分析仪测序

其原理为Edman降解法,分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在pH9、0得碱性环境下,将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S,PITC)与蛋白质或多肽N端氨基酸耦合,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物;然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物,将多肽或蛋白得N一端第一个肽键选择性得切断,释放出该氨基酸残基得噻唑啉酮苯胺衍生物;随后萃取出释放得氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定得乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸);最后以色谱法鉴定出降解下来得PTH-氨基酸种类,从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。质谱技术

质谱所使用得测序方法就是denovo测序,就是根据肽段与惰性气体相碰撞产生得一系列得有规律得片段离子之间得质量差来推断氨基酸序列。我们可以根据肽键断裂处得y离子与b离子来推测氨基酸序列从而不受翻译后修饰与纯度得限制,但就是质谱测序就是有局限性得,1、质谱测序依赖于公共数据库。如果所研究得物种得基因组没有完全被测序,或者其中部分没有对应得序列,那么质谱测序将无法得出正确得鉴定。2、我们使用得搜索引擎得打分与算法可能也会使得我们遗漏一部分得肽段与质谱图得匹配,产生假阳性结果。3、如果有点突变或者未知修饰存在得话,由于搜库算法或者参数设置中没有考虑到,同样也无法得出正确得结果。质谱技术还广泛用于蛋白质得纯度鉴定、分子质量测定、肽(质)谱分析、二硫键、乙酰化、糖基化、磷酰化,以及非共价结合等。5、2、2蛋白质得二级结构

蛋白质得二级结构:就是指蛋白质分子中多肽链本身得折叠方式。形成蛋白质二级结构基础得就是肽单元或肽键平面。蛋白质得二级结构主要依靠氢键来维持结构得稳定性。常见得二级结构元件:α-螺旋β-折叠β-转角β-凸起无规则卷曲β-折叠β-转角α-螺旋无规则卷曲鉴定方法:常用圆二色谱法(Circulardichroism,CD)

圆二色谱法

圆二色光谱仪通过测量生物大分子得圆二色光谱从而得到生物大分子得二级结构。当平面偏振光通过具有旋光活性得介质时,由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同得两种构型,故它们对平面偏振光所分解成得右旋与左旋圆偏振光吸收不同,从而产生圆二色性。远紫外得圆二色谱可用来测定蛋白质得二级结构,近紫外得圆二色谱可用来检测蛋白质侧链得三级结构。应用:蛋白质折叠、蛋白质构象研究,DNA/RNA反应,酶动力学,光学活性物质纯度测量,药物定量分析。天然有机化学与立体有机化学,物理化学,生物化学与宏观大分子,金属络合物,聚合物化学等相关得科学研究。5、2、3蛋白质得三级结构蛋白质得三级结构:就是指具有二级结构得肽链,按照一定方式再进一步卷曲、盘绕、折叠成一种瞧来很不规则,而实际上有一定规律性得三维空间结构。维系三级结构得化学键主要就是非共价键(次级键),如疏水作用、氢键、盐键、范氏引力等,但也有共价键,如二硫键等。5、2、4蛋白质得四级结构蛋白质得四级结构:具有三级结构得蛋白质分子,通过一些非共价键结合起来,而成为具有生物功能得蛋白质大分子,就就是蛋白质得四级结构。亚基:就是指参与构成蛋白质四级结构得、每条具有三级结构得多肽链。亚基虽然具有二、三级结构,但就是在单独存在时并没有生物活力,只有完整得四级结构才具有生物活力。维系蛋白质四级结构得就是氢键、盐键、范氏引力、疏水作用等非共价键。血红蛋白空间结构蛋白质高级结构得实验解析方法蛋白质结构实验分析主要有三大技术平台(1)X-衍射蛋白质晶体结构分析(2)核磁共振波谱分析(3)冷冻电镜技术蛋白质晶体结构X-衍射分析

摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据与减少差错就是目前蛋白质晶体结构分析得两大难题或瓶颈。就是目前分辨率最高得结构测定方法,高通量晶体结构分析中得几大重要环节就是:数据处理与分析、重原子得定位、密度修饰、分子替换、图形整合、模型加工与确认。晶体结构分析得常用软件有SOLVE,RESOLVE等。核磁共振波谱分析

利用核磁共振原理,检测分子质量小于60kμ得蛋白质,通过对其核磁共振谱线特征参数得测定来分析蛋白质得结构与性质,就就是将原始资料利用傅里叶变换转换为不同得峰值,然后采集各种不同得峰组成图谱,并利用生物信息学方法筛选出具有特定结构特征得图谱。常用NMRPipe与SPARKY软件处理这些过程,使用XEASY,DYANA与GARANT等软件分析侧链或骨架结构。冷冻电子显微镜技术

采用高压快速液氮冷冻方法使样品包埋在玻璃态得水环境中,使我们能够观察到生物大分子在天然状态下得结构;同时冷冻得速度极快,把细胞在其生理活动得某些特定时刻固定下来,显示此时得结构特点,进而可通过不同功能状态得瞬时构象变化来研究生物分子得功能。冷冻电镜获得得就是处于天然状态下未经染色得分子得二维投影像。将样品进行不同角度得倾斜所获得得数据进行综合分析,并依据样品得不同特性使用不同得重构技术获得分子得结构,在此基础上观察多种成分得图像变化,追踪生物大分子得装配及其动力学过程。

蛋白质结构得可视化

可视化分析蛋白质得高级结构,有利于从原子间相互作用得层次理解生命活动过程得信息控制机制,更加有效地揭示分子在完成其功能过程中得演化情况,了解蛋白质分子结构与各种微观性质与宏观性质之间得定量关系。只要安装蛋白质分子图形学软件,并获得所需蛋白质结构数据,配以商业软件或免费得小分子图形设计系统,就可开展结构生物信息学得探索性工作。6、1两性与等电点蛋白质就是由α-氨基酸通过肽键构成得高分子化合物,在蛋白质分子中存在着氨基与羧基,因此跟氨基酸相似,蛋白质也就是两性物质。等电点(isoe1ectricpoint,pI):当蛋白质处于某一pH值得溶液中时,蛋白质分子上所带得正、负电荷相等,净电荷为零,蛋白质为兼性离子,此时溶液得pH值称为该蛋白质得等电点(isoe1ectricpoint,pI)。等电点就是蛋白质得特征常数,各种蛋白质有各自得等电点。当蛋白质所处环境得pH大于pI(等电点)时,蛋白质分子带负电荷,pH小于pI时,蛋白质带正电荷,pH等于pI时,蛋白质所带净电荷为零,此时溶解度最小。等电点检测方法:毛细管电泳法,等点聚焦电泳6蛋白质得理化性质6、2水解反应

蛋白质在酸、碱或酶得作用下发生水解反应,经过多肽,最后得到多种α-氨基酸。蛋白质水解时,应找准结构中键得“断裂点”,水解时肽键部分或全部断裂。举例:Edman降解法测定蛋白质得氨基酸顺序,但该法一次只能降解几十个氨基酸残基,因此利用蛋白质得水解性质将蛋白质水解为一些小肽段,分别进行测序,最后进行拼接,获得蛋白质得氨基酸顺序。6、3胶体性质

有些蛋白质能够溶解在水里(例如鸡蛋白能溶解在水里)形成溶液。蛋白质得分子直径(1-100nm)达到了胶体微粒得大小,所以蛋白质具有胶体得性质。在蛋白质表面有亲水基团,能与水发生水合作用,水分子受蛋白质极性基团得影响,定向排列在蛋白质分子得周围,形成水化层,将蛋白质颗粒分开,不致相聚而沉淀。蛋白质在偏离等电点得溶液中,形成电荷层,同性电荷相斥,防止蛋白质颗粒相聚沉淀。6、4沉淀

原因:加入高浓度得中性盐、加入有机溶剂、加入重金属、加入生物碱或酸类、热变性。盐析:向蛋白质水溶液中加入浓得无机盐溶液,可使蛋白质得溶解度降低,而从溶液中析出,这种作用叫做盐析。盐析出得蛋白质仍旧可以溶解在水中,而不影响原来蛋白质得性质,因此盐析就是个可逆过程。利用这个性质,采用分段盐析方法可以分离提纯蛋白质、

不同得蛋白质其性质不同,耐受酸、碱、盐、重金属等得程度也不同,因此我们再对纯化工艺获得得蛋白质进行检测时应充分了解该蛋白质得相关性质及缓冲成分,保证检测任务顺利进行。6、5变性蛋白质得变性:就是指蛋白质在某些理化因素影响下,其特定空间结构破坏而导致理化性质改变与生物学活性丧失得现象。蛋白质变性得物理因素有:高温、高压、超声波、紫外线、X射线等。蛋白质变性得化学因素有:强酸、强碱、浓乙醇、重金属、尿素、去污剂等。蛋白质变性得本质:蛋白质变性只破坏二硫键与次级键,而不涉及肽键得断裂,因此一级结构并未破坏。蛋白质变性后性质得改变:溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。Gly-SDS:还原性-SDS:还原剂为DTT或巯基乙醇,样品需煮沸,高级结构破坏,一级结构未被破坏。非还原性SDS(不含还原剂,但含有SDS),样品不需煮沸,检测蛋白质就是否存在二硫键或多聚体,也可简单判断蛋白质就是否复性成功。Native:就是在不加入SDS、巯基乙醇等变性剂得条件下,对保持活性得蛋白质进行聚丙烯酰氨凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质与酶等生物大分子得生物活性与构像。为什么蛋白质纯度检测用非还原性电泳？应用:如在临床上用高温、高压、紫外线、75%酒精消毒就就是利用了这些变性因素使细菌、病毒得蛋白质变性,从而失去致病作用。在蛋白质得制备过程中,如果提取得目得蛋白就是热稳定得,可利用热变形得方法很方便得除去其它杂蛋白。而对于不利得变性则应该尽量避免。蛋白质得复性:就是指有些蛋白质变性后,如果设法将变性因素除去,该变性蛋白质尚能恢复其空间结构与活性。利用蛋白质得复性特征可对包涵体蛋白质进行变性-复性纯化。例如在包涵体蛋白质纯化过程中常用尿素或盐酸胍对包涵体进行溶解,纯化获得目得蛋白后,再通过透析除去变性剂(尿素、盐酸胍、β-巯基乙醇等),或通过稀释减少变性剂得含量,则其特定得氨基酸顺序重新卷曲、折叠成原来得天然构象,酶得活性也恢复到原来得水平。检测复性成功得方法: