重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修3

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量使用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。

基因工程

是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在

DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。基因工程操作对象：操作水平：原理：结果：意义：基因（DNA）DNA分子水平基因重组创造出人类需要的新的生物类型和生物产品定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限分析基因工程的理论基础1.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？减数分裂I前期：同源染色体上非姐妹染色单体间的互换；减数分裂I后期：非同源染色体上非等位基因的自由组合。有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。分析基因工程的理论基础2.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。3.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③

生物界共用一套遗传密码。生物学（人教版）选择性必修三

生物技术与工程第1节重组DNA技术的基本工具第三章基因工程

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？从社会中来▲

转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右）基因工程的基本工具

外源DNA片段难以进入细胞内，即使进入也很难稳定存在、复制并表达。

在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组

DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。思考：你认为完成基因工程的操作可能需要哪些关键性的工具？“分子运输车”含目的基因的DNA目的基因重组DNA“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”1.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的2.种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）3.作用：能够识别双链

DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开磷酸二酯键（核苷酸之间的磷酸酯键）4.结果：限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”5′3′5′3′TACGTACTGAAT5′5′3′3′①EcoRI限制酶：能特异性识别5'-GAATTC-3'

序列，并在G与A之间切割CT5′3′5′3′TAGCAGATTA中轴线当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。黏性末端（5'AATT-3'）限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”②SmaI限制酶：能特异性识别5'-CCCGGG-3'序列，并在C与G之间切割5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG中轴线5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG5′3′5′3′平末端当限制酶在它的识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。核心归纳DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；

也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。限制酶所识别的序列的特点是：都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的

，称为回文序列。正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致。CT5′3′5′3′TAGCAGATTA中轴线5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG中轴线SmaIEcoRI限制酶名字的由来EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ资料卡思考·讨论1.根据上述所学，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？限制酶是原核生物的一种防御工具，当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割侵入细胞的外源DNA，使之失效，以保证自身安全。2.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。3.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶

Spe

Ⅰ进行切割，B片段分别用限制酶

Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ、EcoRⅤ和

Xho

Ⅰ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）A片段经限制酶切割一次可断开___个磷酸二酯键，产生___个游离的磷酸基团，产生___个黏性末端，其黏性末端是_____________。2225'CTAG-3'思考·讨论3.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶

Spe

Ⅰ进行切割，B片段分别用限制酶

Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ、EcoRⅤ和

Xho

Ⅰ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（2）同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？相同；不一定，不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端，如SpeⅠ和XbaⅠ。识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。思考·讨论3.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶

Spe

Ⅰ进行切割，B片段分别用限制酶

Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ、EcoRⅤ和

Xho

Ⅰ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（3）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶

Spe

Ⅰ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？限制酶

XbaⅠ；因为限制酶

XbaⅠ与

SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。思考·讨论DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。5′3′TACGTACTGAAT5′3′5′3′CGCGCG5′3′CGCGCG切口切口切口CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCGDNA连接酶——“分子缝合针”2.种类：种类来源大肠杆菌T4噬菌体相同点不同点E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶都能将双链

DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶DNA连接酶——“分子缝合针”

由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快

DNA

连接酶的连接速度，而平末端则不能。所以T4DNA连接酶连接黏性末端的速度比平末端的速度更快。为什么T4DNA连接酶连接平末端的效率相对较低？DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？▲

DNA复制中DNA聚合酶发挥作用（1）DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，不需要模板。

此外，它们虽同为蛋白质，但组成、性质等各不相同。核心归纳与DNA相关的几种酶的比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶DNA水解酶作用对象作用部位作用结果DNA分子磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA分子片段磷酸二酯键形成重组DNA分子脱氧核苷酸磷酸二酯键形成新的DNA分子DNA分子氢键形成单链DNA分子DNA分子磷酸二酯键形成脱氧核苷酸质粒基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：将外源基因送入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行大量复制2.种类：、噬菌体、动植物病毒等是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA。▲

大肠杆菌及质粒结构模式图真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。利用病毒对宿主细胞的侵染性基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.载体需具备的条件：（1）有一个至多个限制酶切割位点（便于插入目的基因）（2）能在受体细胞中复制并稳定保存（使目的基因稳定存在且数量可扩增）（3）具有特殊的标记基因（便于重组DNA分子的筛选/将含有目的基因的受体细胞筛选出来）（4）对受体细胞无害、易分离（避免受体细胞受到损伤）自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制分析载体的种类和载体需具备的条件1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。2.根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由？合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。归纳：标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：标记基因进行筛选重组DNA分子举例目的基因lacZ

基因氨苄青霉素抗性基因

LacZ

基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解X-gal产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。

请分析下列3种大肠杆菌在含X-gal和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。无法存活存活；白色存活；蓝色归纳：标记基因的筛选原理5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'重组DNA分子

请你在上述序列中找到EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。讨论：1.剪刀和透明胶带分别代表哪种“分子工具”？2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？思考·讨论重组DNA分子胶带胶带思考·讨论探究·实践DNA的粗提取与鉴定1.实验思路：裂解细胞使核酸分子释放出来从释放出来的细胞成分中分离核酸分子纯化获得核酸分子探究·实践DNA的粗提取与鉴定2.实验原理：（1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精初步分离DNA和蛋白质DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于

2mol/L的NaCl溶液溶解DNA（2）鉴定DNA的原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。探究·实践DNA的粗提取与鉴定3.材料用具：（1）选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。（2）试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水→提取、溶解DNA→析出DNA→溶解DNA→鉴定DNA（要现配现）称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨洋葱探究·实践DNA的粗提取与鉴定4.方法步骤：取材、研磨研磨目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。探究·实践DNA的粗提取与鉴定4.方法步骤：取材、研磨过滤或离心方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。思考：①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？

可能含有核蛋白、多糖等杂质②低温放置几分钟有什么作用？

抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；

抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；用冷却的酒精析出DNA探究·实践DNA的粗提取与鉴