动物细胞工程动物细胞融合技术与单克隆抗体高二生物教学精优课件（人教版2019选择性必修3）1

第2节

动物细胞工程——动物细胞融合技术与单克隆抗体贺老师第2章细胞工程…….由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上。…….每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体抗体1抗原1B细胞1刺激抗体2抗体3抗体4抗原2抗原3抗原4B细胞2B细胞3B细胞4刺激刺激刺激产量低、特异性差需要获得获得大量的B细胞1问题:若我们只需要大量抗体1，有什么办法吗？早期获得抗体的方法及缺陷(2)缺陷:纯度低、向动物体内反复注射某种抗原(1)方法:每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞单一B淋巴细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体（单克隆抗体）单克隆抗体克隆单一的B淋巴细胞，形成B淋巴细胞群，由细胞群产生大量的纯度高的抗体一个正常的B淋巴细胞不可能无限增殖的。怎样才能使B细胞在产生抗体的同时，具备无限增殖能力呢？大量制备单一抗体的思路：单个细胞无性繁殖化学性质单一，特异性强单：克隆：抗体：动物细胞融合动物细胞培养单克隆抗体【资料3】1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案：一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖杂交瘤细胞单克隆抗体既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。动物细胞融合技术如何让两个不同的来源动物细胞融合为杂种细胞？灭活病毒诱导法肺结核病人病理切片动物细胞融合技术病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？细胞核的融合融合完成的标志：某种病毒紫外线灭活丧失感染活性(不感染细胞)保留抗原结构(诱导细胞融合)动物细胞融合技术1.概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.原理：细胞膜具有一定的流动性3.结果：形成杂交细胞4.诱导方法：与植物原生质体融合的方法相同物理法电融合法等化学法聚乙二醇（PEG）融合法生物法灭活病毒诱导法动物细胞融合特有细胞核的融合→具有原来两个或多个细胞的遗传信息。6.

意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。5.融合实质及完成的标志：单克隆抗体的制备注射特定抗原从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种已免疫的B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合小鼠的脾脏中获取多种杂交细胞获得产生特定抗体的B淋巴细胞阶段一：动物细胞融合思考：只考虑两两融合，B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后，培养基中共出现几类细胞？其中融合的细胞有几类？阶段二：筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（多种）第一次筛选B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞骨髓瘤细胞自身融合未融合的骨髓瘤细胞B1-瘤B2-瘤B3-瘤单克隆抗体的制备阶段二：筛选杂交瘤细胞（第一次筛选）单克隆抗体的制备【资料4】细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。

筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基喋呤（HAT选择培养基）B淋巴细胞合成DNAS途径D途径不能无限分裂增殖骨髓瘤细胞合成DNAD途径能无限增殖B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长B1-瘤B2-瘤B3-瘤…….阶段三：筛选分泌专一抗体的杂交瘤细胞（第二次筛选）方法：用培养液

稀释培养杂交瘤细胞(多种)每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞抗原—抗体杂交抗原—抗体特异性结合原理：抗体检测呈

阳性的杂交瘤细胞

多孔细胞培养板阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志意义主要用途细胞膜具有一定的流动性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、高Ca2+-高pH融合法；离心法、聚乙二醇（PEG）融合法聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因目的

筛选方法

筛选出杂交瘤细胞筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基（HAT培养基）筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。克隆培养、抗体检测：用多孔细胞培养板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞阶段四：动物细胞培养抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养体内培养(注射到小鼠腹腔内)单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取优点：可大规模培养，大量生产缺点：需要人为控制培养条件，成本相对较高优点：易于控制培养条件，成本较低缺点：规模小，产量少——获得大量单克隆抗体单克隆抗体的制备培养杂交瘤细胞的方法有哪些？从哪里收集产物？方法的优缺点？单克隆抗体第二次筛选杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养第一次筛选骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术既能大量繁殖又能产生抗体注射抗原单克隆抗体制备的过程中，应用到的技术手段单克隆抗体的制备细胞膜的流动性细胞增殖小结：【拓展】

抗体的人源化

利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。将非人源（如鼠源）抗体的关键功能区域移植到人类抗体框架中，以降低免疫原性并提高治疗效果。讨论：1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。单克隆抗体的应用抗体—药物偶联物（antibody-drugconjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。讨论：2.除了细胞毒素外，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用1运载药物——“生物导弹”--靶向运输药物治疗疾病单克隆抗体的应用1运载药物抗体—药物偶联物（ADC）的局限性：（1）成本高（2）抗体与药物的连接可能分开，导致药物作用于健康细胞（3）脱靶效应：药物不仅结合到目标靶点，还意外结合到其他非预期的分子上，导致副作用或其他不良反应。——“生物导弹”--靶向运输药物治疗疾病单克隆抗体的应用2诊断试剂如何鉴定血型？A型B型AB型O型红细胞抗原（凝集原）抗体A抗原B抗原A和B抗原无B抗体A抗体无A和B抗体A型血B型血O型血AB型单克隆抗体的应用2诊断试剂怀孕后，人体内的激素会发生较大改变，如绒毛膜促性腺激素的含量会大大增加，可否利用激素含量的变化来检测是否怀孕？如何检测？原理是什么？制备抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体来检测其尿液判断是否怀孕原理：抗原和抗体能够特异性结合优势：在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。新冠病毒抗原检测试剂盒甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备____________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤结合同位素的单抗荧光标记的单抗2诊断试剂单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用3作为药物治疗疾病单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病如果被毒蛇咬伤，如何快速治疗？抗毒血清的主要作用成分是相应的抗体单克隆抗体制备过程相关知识点检测（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理____________________________________________________（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量增殖，又能产生抗体（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选________________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即__________________________________（8）抗体检测原理_______________________________________（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点_____________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳单克隆抗体制备