高三生物二轮复习：PCR 技术的热点考法

二轮复习PCR技术的热点考法xxxPCR1PCR2链Ａ链ＢPCR3Ａ－Ｂ融合基因基因Ａ基因Ｂ互补PCR4P1P2P4P33’--5’-3’5’-5’--5’5’--5’5’--3’3’--5’PCR1和PCR2分开进行链A和链B部分互补配对PCR3不需要引物PCR4(用P1和P4扩增融合基因)1.重叠延伸PCR——获得融合基因5’-3’--3’5’--3’-5’3’--5’5’-3’--3’-5’5’--3’3’--5’①②③④⑤⑥⑦⑧①和④⑤和⑧②和⑦3’--5’5’--3’③和⑥5’-3’--3’-5’5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’不能PCR延伸可以PCR延伸注意：经过PCR1和PCR2获得的两种DNA混合，经高温变性再低温复性后，只有一种情况可以进行PCR延伸。1.重叠延伸PCR——获得融合基因引物a引物c引物b引物d产物AB产物CDAB上链CD下链突变产物ADPCR1PCR2PCR3PCR4大量突变产物AD至少第2次循环获得至少第2次循环获得CGAT定点突变1.重叠延伸PCR——获得定点突变基因注意：经过PCR1和PCR2获得的两种DNA混合，经高温变性再低温复性后，只有一种情况可以进行PCR延伸。3’5’3’5’P1P23’5’3’5’P1P22.PCR定点突变技术——在某一引物中引入定点突变3’5’3’5’P1P23’5’P1P23’5’P2P15’3’5’3’2.PCR定点突变技术——在某一引物中引入定点突变3’5’P1P23’5’P2P13’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’2.PCR定点突变技术——在某一引物中引入定点突变突变位点只在目的基因的端部引物aCGAT定点突变引物b产物ABPCR1引物c大引物ABPCR2至少第2次循环获得至少第2次循环获得2.PCR定点突变技术——大引物突变上游引物突变位点在目的基因的中间常规下游引物常规上游引物注意：PCR2利用PCR1的产物作为引物，因此两轮PCR不能同时进行。2.PCR定点突变技术——大引物

2.PCR定点突变技术——大引物

是在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。常用的荧光探针如TaqMan探针，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在PCR扩增过程中，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步‌。3.荧光定量PCR的基本原理1.反转录‌(1)提取RNA‌：首先从组织或细胞中提取总RNA。‌(2)逆转录‌：使用逆转录酶（ReverseTranscriptase）将RNA反转录成cDNA（互补DNA）。这一步需要引物（如Oligo(dT)或随机引物）来启动反应，生成cDNA。2.PCR扩增‌(1)模板准备‌：以cDNA为模板，使用DNA聚合酶和特定的引物进行PCR扩增。‌(2)扩增过程‌：PCR通过循环的变性、退火和延伸步骤，将cDNA数量指数级增加，从而获得足够数量的DNA产物用于后续分析。3.检测使用荧光染料或比色剂等方法检测PCR产物的数量，从而确定RNA样本中特定基因的表达水平。4.RT-PCR其基本原理可以分为三个主要步骤：‌反转录‌、‌PCR扩增‌和‌检测‌获得的目的基因与体内基因的碱基序列不同（无内含子等）‌5.反向PCR测定未知DNA区域

5.反向PCR测定未知DNA区域

已知序列______________________________________________________________________