质粒的线性化及其用途

PCR是扩增DNA的一项技术，在设计好引物后可以实现线性DNA的指数式扩增。那么环形质粒能否进行PCR，如何设计引物，扩增的产物是什么？

如果是线性DNA的话，引物一般是依据模板DNA两端的序列进行设计，延伸到模板的末端即停止。质粒是环形双链没有末端，每条链均需要引物，引物需要2种。由于没有末端理论上来说引物结合在模板链的任何一个位置均可以，延伸至该引物的5’端停止，由于PCR体系无DNA连接酶，因此最后一个脱氧核苷酸无法和引物的5’端磷酸形成磷酸二酯键成环，因此质粒如果做PCR只能得到线性DNA。

如何实现质粒线性化

由于两条链的引物位置设计不同，可能导致环形质粒的扩增产物有2种，一是松散环形DNA（也可以说带有黏性末端DNA），二是线性DNA。

1、产物是线性DNA

若要想得到环形DNA，两个引物的5’末端相对“接在一起”中间不能再有碱基，这样能够得到末端平齐完全线性化的双链DNA。如上图所示。

2、产物是具有粘性末端（3’突出）的线性DNA

如果两个引物的5’末端之间有碱基的话，会得到具有粘性末端的线性DNA，如下图。不过由于末端互补，可以靠碱基互补配对黏合在一起形成环形。（可以联想目的基因如果用同一种限制酶酶切的话可能造成目的基因环化），不过如果没有DNA连接酶的话，这个环形质粒是有切口的，属于松散环形DNA，其本质还是线性DNA。

3、产物是具有粘性末端（5’突出）的线性DNA

如下图的质粒，我们把引物设计成完全互补，红色是引物，那么PCR后的产物是有粘性末端的线性DNA，由于5’段突出，所以在DNA聚合酶（PCR体系里的耐高温的DNA聚合酶）的作用下沿着3’端继续延伸，直至补齐末端成为完全平齐的线性DNA。当然也有可能因为粘性末端的互补成为松散环形DNA。

4、在引物的5’添加非互补序列得到具有粘性末端（5’突出）的线性DNA

如果引物按照下图设计，在引物的5’添加非互补序列也会得到具有粘性末端的线性DNA。同样有可能被DNA聚合酶补齐成为平齐的线性DNA，也可能因为碱基互补成为松散环形。

质粒线性化的用途1

反向PCR

一般的PCR我们需要知晓目的基因两端的序列方便我们设计引物，如果仅仅知道目的基因内部一小段DNA，我们如何才能扩增该基因进而进行测序呢？我们可以想法先把目的基因环化（用同种限制酶切产生相同的粘性末端即可），然后根据刚才分析的第一种引物设计方法即可扩增得到线性DNA，得到的线性DNA可以用于测序。如下图所示

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同源重组在质粒的任意位点插入目的基因

如图所示，质粒经PCR后可以线性化，目的基因PCR时采用的引物除了和目的基因特异性互补外，在每个引物的5’端需要添加线性化载体两个末端的序列，这样扩增后的目的基因产物含有线性质粒两端的同源序列，根据同源重组插入载体中，同源重组的模式图如下。类似于减数分裂时的交叉互换。

除了扩增目的基因添加线性质粒末端同源序列外，也可以反过来，线性质粒PCR时设计引物如上述第4种类似在引物5’端添加目的基因两端的同源序列，可以达到相同的效果。如下图所示

这种做法的优点相比双酶切来说同样可以保证插入方向，重组效率比双酶切高，而且可以不受质粒上酶切位点的限制，可以通过合理设计引物在任意位点插入目的基因。

在上述采用同源重组的方法插入目的基因时，