基因工程的基本操作程序（第1课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

构建基因表达载体的目的：①②(基因工程的核心)有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。目的目的基因表达载体的本质是DNA真核细胞基因结构编码区非编码区非编码区编码区非编码区非编码区启动子终止子RNA聚合酶识别结合位点，启动转录终止转录外显子内含子原核细胞基因结构拓展延伸：真核细胞和原核细胞基因转录过程的区别拓展延伸：真核细胞和原核细胞基因转录过程的区别转录前体信使RNAmRNA转录后加工外显子内含子转录真核生物的一个基因中既含有编码氨基酸的外显子，又含有不编码氨基酸的内含子，而且外显子与内含子都被转录，这样形成的RNA称为前体信使前体信使RNA序列与作为模板的DNA序列完全互补。前体信使RNA中不编码氨基酸的序列在RNA自身的催化作用下被切除,编码氨基酸的序列连接在一起，形成信使RNA基因RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录过程决定转录的结束载体DNA复制的起始点，若复制原点被破坏，则载体将不能复制一般为抗生素抗性基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞一个切口，两个黏性末端两个切口，四个黏性末端用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，目的基因应插入启动子与终止子之间。若仅是为了扩增目的基因，不需要获得表达产物，则不一定要插入启动子与终止子之间。启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)思考：使用一种DNA限制酶进行切割，会得到几种重组DNA？有何缺点？将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有:质粒目的基因自身环化目的基因自身环化质粒自身环化质粒与目的基因反向连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接自身连接怎么改进解决以上问题？用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。限制酶a切割abDNA连接酶连接限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割ab双酶切的优点:(1)防止质粒自身环化，防止目的基因自身环化(2)防止质粒与目的基因反向连接载体与基因表达载体的辨析载体相同点:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段不同点:基因表达载体在载体基础上增加了启动子,目的基因,终止子限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。②保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。③确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶,如图甲中PstⅠ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。(2)根据常规质粒的结构确定限制酶的种类(3)若质粒上标出T-DNA片段,则所选限制酶切割位点应位于T-DNA片段中。设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则下图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取,分析如下:只有该步骤没涉及碱基互补配对原则②将目的基因导入植物细胞的方法：①特点：①②此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组运用农杆菌转化法，能将目的基因直接导入植物受体细胞吗？导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成"基因污染”。特点：①②受体细胞是体细胞受体细胞是受精卵此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌第二次导入(非人工操作):含目的基因的T-DNA导入受体细胞第二次拼接(非人工操作):插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上该过程涉及几次拼接和几次导入？两次拼接和两次导入，需无菌操作,以防止杂菌污染干扰实验【易错警示】最终拼接到受体细胞上的是重组Ti质粒上的T-DNA，而不是完整的重组Ti质粒思考：将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。判断：可用DNA分子杂交或抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达。✕，用DNA分子杂交技术检测是否插入了目的基因，用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达一、分子水平的检测（1）检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA分子杂交（Southern-blot)流程图DNA分子杂交结果图一、分子水平的检测（2）检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或分子杂交技术RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图Bt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳一、分子水平的检测（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转Bt基因非转基因二、个体水平的检测抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株接种棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法分子检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR扩增DNA分子杂交技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR扩增分子杂交技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较功能活性。选择受精卵作为受体细胞的理由:①体积大、易操作;②全能性高，易培养成完整个体将目的基因导入原核细胞优点与缺点:优点:生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作;缺点:原核细胞作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性,需要在体外进行再加工。显微注射1.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板进行PCR,扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列相关叙述错误的是()A.PCR技术依据的原理是DNA半保留复制B.PCR技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C.选择图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对来确定插入位置B[解析]PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶,但不需要解旋酶,高温下双螺旋可以打开;DNA的两条链反向平行,子链从引物的3'端开始延伸,利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列。故选B。2.科研团队利用农杆菌转化法将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中,使它呈现出自然界没有的颜色变异。以下说法正确的是()A.在自然条件下,农杆菌能侵染单子叶植物和裸子植物,而对大多数双子叶植物没有侵染能力B.当农杆菌感染植物时,Ti质粒会进入受体细胞的染色体上C.利用农杆菌介导的矮牵牛转基因技术有两次转化,第一次是将含目的基因的重组Ti质粒导入Mg2+处理的农杆菌中D.检测转基因矮牵牛是否培育成功的第一步可以采用PCR等技术D[解析]农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力,A错误;当农杆菌感染植物时,只有农杆菌Ti质粒的T-DNA片段进入植物细胞的染色体上,B错误;利用农杆菌介导的矮牵牛转基因技术有两次转化,第一次是将含目的基因的重组Ti质粒导入Ca2+处理的农杆菌中,C错误。√××D外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)PCR不仅可以便捷地扩增DNA,还能直接扩增RNA()(3)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制()(4)载体与目的基因结合的过程发生在细胞内()(5)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()(6)基因工程的操作步骤中,只有将目的基因导入受体细胞这一步骤没涉及碱基互补配对原则()(7)构建基因表达载体时要注意保证目的基因上有启动子、终止子及标记基因等()(8)目的基因一定是编码蛋白质的基因()(9)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中