第三章第一节基因工程（基因表达载体的构建）

第三章基因工程第一节基因工程及其技术

——基因表达载体的构建（1）获得目的基因的方法有哪些？化学合成法、基因文库法。（2）左图中质粒和目的基因需要用哪种酶切割？哪种酶连接在一起？限制酶、DNA连接酶。

上图中携带目的基因的重组质粒需要具备哪些特点呢？一、基因表达载体的构建

人们构建的基因表达载体不仅要使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。（一）基因表达载体的组成阅读教材97页第一段的内容，结合图3-1-17思考基因表达载体需要具备哪些结构？这些结构分别有什么作用？学生活动

基因表达载体除含有目的基因外，还必须有复制原点、启动子、终止子、标记基因等。（一）基因表达载体的组成1．启动子

（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段。

（2）位置：目的基因的上游，紧挨转录的起始位点。

（3）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出相应的mRNA。（一）基因表达载体的组成2．终止子（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段。（2）位置：目的基因的下游。（3）功能：使转录在需要的地方终止。3．标记基因

初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）或某些生化标记基因。（一）基因表达载体的组成4．复制原点

能与特定的受体细胞相匹配，使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传。易错辨析启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别编码区基因基因基因DNADNA分子上具有遗传效应的片段称为基因放大非编码区非编码区（调控序列）（调控序列）启动子终止子内含子外显子编码区的上游编码区的下游前体RNA转录成熟RNAAUGUAG易错辨析

启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段mRNA上三个相邻的核糖核苷酸目的基因上游目的基因下游mRNA的首端mRNA的尾端RNA聚合酶识别和结合的部位决定转录的终止翻译的起始信号决定翻译过程的终止（二）基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建是基因工程操作的核心。1．用一定的限制酶切割载体，使其出现一个有黏性末端的切口。2．用同种的或产生相同黏性末端的限制酶切割目的基因。3．加入适量DNA连接酶，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处。DNA连接酶表达载体含目的基因的DNA带有黏性末端的切口带有相同黏性末端的目的基因片段基因表达载体用能产生相同黏性末端的限制酶切割（二）基因表达载体的构建过程难点突破关于限制酶的选择

基因表达载体的构建过程中，一般用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端（或平末端)，便于二者进行连接。但有时可用两种产生不同黏性末端的限制酶切割载体和目的基因，这样可使目的基因定向插入载体，同时可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接和目的基因与载体之间的反向连接。拓展基因工程中的载体1．载体的概念：载体是将外源DNA或基因导入寄主细胞进行扩增或表达的工具。2．载体的种类：按功能分为克隆载体和表达载体两类。有一些兼有克隆载体和表达载体的特点。（1）克隆载体——最基本的载体。①来源：从病毒、质粒或高等生物细胞中获得的DNA均可以作为克隆载体。②过程：在克隆载体上插入适当大小的外源DNA片段→将重组后的载体引入宿主细胞→在宿主细胞中通过克隆获得目的基因。（2）表达载体①概念：要使外源基因（目的基因）能在宿主细胞中表达，必须将它放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这类载体称为表达载体。②举例：表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌质粒，其基本骨架由来自pBR322和pUC的质粒复制起（原）点、氨苄青霉素抗性基因、相应的启动子和终止子，以及多克隆位点构成。二、将目的基因导入受体细胞

阅读教材97~98页的内容，梳理将目的基因导入不同受体细胞的方法有何不同？各自的转化过程是怎样进行的？用流程图的方式绘制出来。学生活动受体细胞类型方法植物细胞哺乳动物细胞微生物细胞农杆菌转化法显微注射法（主要）病毒感染法Ca2+处理法（感受态细胞法）（一）将目的基因导入植物细胞

为什么选用农杆菌？农杆菌有什么特点？1．原理

（1）农杆菌

农杆菌是一类生活在土壤中的原核微生物，能在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，但不会感染大多数单子叶植物。

（2）当双子叶植物或裸子植物收到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌向伤口处移动。

（3）农杆菌含有Ti质粒，上面有一段转移DNA（T-DNA），能进入受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。目的基因插入Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞插入植物细胞中的染色体DNA上目的基因表达3．特点：

经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物。2．过程受精卵显微注射受精卵移植到处于相同发情周期的母畜子宫内受精卵发育获得具有新性状的动物（二）将目的基因导入哺乳动物细胞1．显微注射法2．病毒感染法

用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。（三）将目的基因导入微生物细胞1．感受态细胞

经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。Ca2+处理微生物细胞感受态细胞将重组的基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中在适当的条件下完成转化培养基上筛选带目的基因的微生物2．过程易错辨析1．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性而且容易表现全能性。3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。有内质网和高尔基体三、目的基因及其表达产物的检测鉴定1．检测与鉴定的内容、方法

阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺少的内容。检测水平检测内容方法结果显示分子水平的检测DNARNA蛋白质个体水平的检测检测水平检测内容方法结果显示分子水平的检测DNARNA蛋白质个体水平的检测1．检测与鉴定的内容、方法检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因DNA分子杂交法（基因探针+待测转基因生物的DNA）是否显示出杂交带检测目的基因是否转录分子杂交技术（基因探针+待测转基因生物的mRNA）检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交包括抗虫、抗病的接种试验，抗冻的耐寒试验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等2．分子杂交技术的原理与过程（1）DNA分子杂交技术①原理：具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。②过程与结果：

提取待测转基因生物细胞中的DNA→与用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段（基因探针）进行杂交。

若待测DNA中有能与基因探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。2．分子杂交技术的原理与过程（2）DNA—mRNA分子杂交技术①原理：碱基互补配对原则。②过程与结果：

提取待测转基因生物细胞中的mRNA→用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交→如果有杂交带出现，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。2．分子杂交技术的原理与过程（3）抗原—抗体杂交技术①原理：抗原与抗体的特异性结合。②过程与结果：

提取待测转基因生物细胞中的蛋白质，并与相应的抗体进行杂交→如果有杂交带出现，说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。

抗原—抗体杂交技术中目的基因产生的蛋白质是抗原还是抗体？

抗原。1．将目的基因导入受体细胞的三种类型目的基因植物细胞主要是农杆菌转化法主要是显微注射法微生物细胞主要是Ca2+处理法哺乳动物细胞导入导入导入课堂小结表现翻译2．目的基因检测与鉴定的“两个水平”受体细胞mRNA蛋白质抗原—抗体杂交分子杂交技术DNA分子杂交法性状如抗虫接种实验外源基因是否显示杂交带是否显示杂交带是否显示杂交带是否表现特定性状导入检测检测检测检测转录分子水平检测个体生物学水平检测1．运用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，达到大规模生产凝乳酶的目的。下图表示用作运载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是（

）BA．用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体B．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌C．可用PCR技术大量扩增目的基因D．用Ca2+处理大肠杆菌使其易于转化2．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法错误的是（

）CA．X是能合成胰岛素的细菌细胞B．质粒应具有多个限制酶切点C．基因与运载体的重组只需要DNA连接酶D．该细菌的性状被定向改造3．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是（）A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异D