合成生物系统学习资料

合成生物系统Syntheticbiologysystems李琬生物物理教研室分子生物学馆212liwan@教学大纲掌握：相关概念，基本路线，最小基因组和必需基因，重构T7噬菌体了解：双不对称PCR，两步合成完整基因法，递归PCR，装配PCR，转化介导的重组，TBIO法与TBC法，聚合酶链组装法，LCR与PCA的结合，应用程序化微芯片精确合成基因，尺蠖延伸方法，多米诺克隆与BreT重获，人工合成脊髓灰质炎病毒，合成基因组控制的ΦX174噬菌体，重构1918年西班牙流感病毒，人造基因组控制的活细胞生物模块——生命体的设计与改造最小基因组——部件的功能实现合成基因组技术——技术支持从头合成基因组合成简化的生物系统合成多细胞系统无细胞合成生物系统※△※△※※从头合成（denovosynthesis）基因组合成基因获得自然界中不存在的基因合成基因组制造一个由化学合成基因组控制的合成细胞。合成基因组学对目的基因进行人工设计根据设计对基因组进行合成、组装及移植合成基因组策略自上而下大规模敲除微生物基因组序列自下而上从头全合成及拼接成完整的基因组

相关概念基本路线方法※※相关概念从头合成生物体内用最原始的原料、最简单的前体物质，消耗较多能量，逐步合成生物分子的途径。※从头合成基因以A、C、T、G四种碱基为原料，按照一定的目的要求，以一定的顺序最终连接成具有一定长度基因的过程。从头合成基因组从头合成个体或细胞所含的全套基因的过程。基本路线按照预先设计的DNA序列，以A、C、T、G四种碱基为原料，按照需要依次合成寡核苷酸；将寡核苷酸按一定的顺序组装成较短的DNA序列，对于基因长度较短的序列（400～600bp），在这一步即可完成基因合成；※按一定的顺序将不同的寡核苷酸连接成长的DNA片段及长基因序列（kb）；通过酶连接法或体内重组，合成更长的基因并组成基因组的长片段（>10kb）；在大肠杆菌及酵母中依次组装，最后达到超过1Mb的基因组；将合成的基因组移植到细胞中去，并使合成的基因组的基因按要求表达。合成基因和基因组的方法（1）双不对称PCR（2）两步合成完整基因法（3）递归PCR（4）装配PCR（5）转化介导的重组（6）TBIO法与TBC法（7）聚合酶链组装法（8）LCR与PCA的结合（9）应用程序化微芯片精确合成基因（10）尺蠖延伸方法（11）多米诺克隆与BreT重获聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链低温（60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链（1）双不对称PCR(dualasymmetricPCR，DA-PCR)基本原理采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA。双不对称PCR就是在一个PCR反应体系中，同时应用4个引物以化学方法合成长度为17～100个碱基的4个相邻的寡核苷酸，这4个寡核苷酸之间有15～17个碱基的重叠序列。在PCR过程中，这些寡核苷酸作为引物。在随后的PCR扩增中，这些双不对称扩增的片段通过重叠序列，最终产生一个双链全长产物。（2）两步合成完整基因法DA-PCR与OE-PCR（重叠延伸PCR，overlapextensionPCR）结合的方法。能有效降低成本，节约时间。靶DNA被分割成寡核苷酸25~50bp将每四个相邻的寡核苷酸引物混合每个DA-PCR主要产物横跨由四个寡核苷酸所覆盖的整个序列，且与相邻DA-PCR产物重叠达90bp。利用DA-PCR产物间有扩增的部分重叠序列，可以有效地合成全基因产物。DA-PCR产物混合并纯化（3）递归PCR（recursivePCR）一种合成完整基因的新方法。优点相对于传统方法，节约成本，并简化了基因的合成过程，而且有合成更大基因片段的潜力。化学合成的寡核苷酸仅代表每条链中的部分序列。将寡核苷酸混合并进行PCR3’端重叠序列扩展延长产生了更长的双链基因产物重复以上过程直到获得全长基因产物（4）装配PCR（assemblyPCR）由大量寡核苷酸一步合成一个基因及一个完整的质粒的一种方法。优点成本较低过程合成寡核苷酸基因装配基因扩增克隆56个寡核苷酸编码启动子区和bla结构基因的双链，正负链均由28个寡核苷酸构成。互补的寡核苷酸存在20nt重叠序列，所有寡核苷酸可以覆盖双链的全部序列。质粒（5）转化介导的重组（transformation-associatedrecombination，TAR）特异性的克隆人类DNA的方法可用于克隆包含重复序列的大片段DNA端粒将制备的携带两个遗传标记M1和M2的人类DNA的线性载体，直接转移到酵母原生质体中。人类DNA与载体上的重复序列间进行TAR。（6）TBC法与TBIO法TBC：热力学平衡法（thermodynamicallybalancedconventionalmethod）TBIO：热力学平衡双向延伸法（thermodynamicallybalancedinside-out）TBC基于PCR并优化引物的基因合成方法。用TBC引物组合成四组连续的重叠双链DNA片段PCR两步合成全长并扩增的重叠DNA片段连续的重叠DNA片段的PCR装配合成全长DNA片段TBIO基于PCR的基因合成方法能够合成具有高保真度的、较长的基因序列首先合成中心片段再纯化所合成的产物经PCR一步合成全长的内部DNA片段用前5对引物合成起始内部双链DNA片段使用5对外部引物，由内向外双向延伸内部起始片段经PCR产生全长DNA片段（7）聚合酶链组装法(polymerasechainassembly，PCA)将覆盖整个基因序列、有部分重叠的寡核苷酸通过退火、延伸变得更长一些，然后再与其他寡核苷酸或延伸产物之间通过变性、退火及延伸的循环，最终得到全长基因。（8）LCR与PCA的结合LCR：连接酶链反应（ligasechainreaction）由一系列化学合成的寡核苷酸组合全长基因组。合成噬菌体设计、合成、凝胶纯化寡核苷酸在Taq连接酶的作用下进行连接反应寡核苷酸的PCA过程PCR扩增上步合成的DNA分子将合成的线性DNA分子转换成具有感染性的环状分子（9）应用程序化微芯片精确合成基因（10）尺蠖延伸方法（inchwormelongation，IWe）克隆大型DNA在载体中克隆并延伸基因基本思路LPS：landingpadsequence，停泊位点序列LPA：LPSarray，2个依次排列并且方位正确的LPS。靶基因通过与LPS介导的同源重组克隆入载体中。先参照靶基因PCR合成2个小DNA侧翼序列LPS，并整合在载体的克隆位点LPS以串联形式与载体相连接产生一组LPA质粒（11）多米诺克隆与BreT重获（dominocloningandBacillusrecombinationaltransferretrieval）可以广泛应用于任何重组基因组设计。多米诺方法一系列的靶DNA片段（多米诺克隆）通过同源重组连接到载体中。当按照目的顺序排放这些多米诺克隆，并重复这种连接反应时，会使原始DNA序列在载体中延长。当通过多米诺方法把完整靶基因都重组进载体后进行BreT重获。BreT重获将线性化的BreT质粒转化带有靶基因的细胞，通过同源重组，BreT介导的转移发生，靶DNA以适合多种应用的环状质粒形式重获。方法引物原理产物DA-PCR4个不等量PCR全长DA-PCR+OE-PCR4个一组PCR全长递归PCR寡核苷酸PCR完整基因装配PCR大量寡核苷酸PCR基因、完整质粒TAR重组人类DNA，包含重复序列的大片段DNATBC4组PCR全长TBIO内部＋外部PCR高保真度、较长基因序列PCA寡核苷酸全长LCR+PCA寡核苷酸全长微芯片PCRIwe重组大型DNABret重组任何基因组合成简化的生物系统最小基因组和必需基因人工合成脊髓灰质炎病毒合成基因组控制的ΦX174噬菌体重构T7噬菌体重构1918年西班牙流感病毒人造基因组控制的活细胞※△载体细胞应具有精简基因组，即最小基因组，从而最大限度地降低噪声干扰，使得其他阻碍通路不能够对设计的系统产生影响，减少了不希望出现的相互作用，提高对所设计系统的可控性和可操作性。最小基因组和必需基因（essentialgenes）※最小基因组在最适宜条件下维持细胞生长繁殖所必需的最小数目的基因最少需要多少个蛋白质编码基因才能支持一个完整的细菌作为特定功能的基因的载体被转移到细胞底盘中，最终构建具有特定功能的最小人工细胞。细胞底盘（硬件）：包含代谢系统的容器或分隔的空间，其中不包括遗传信息或基因组（软件）。研究的核心确定基因对于维持系统正常生命活动的必需性找到必需基因构建策略：自上而下：以活细胞为基础来检验多少个基因被删除之后仍能保持细胞的生存能力自下而上：对必需基因进行重新设计、合成与组装。必需基因维持生命体正常生命活动所必需的基因。把基因组中的基因逐一剔除来鉴别该基因是否必需。14种细菌和6种真核生物基因组——近1万个必需基因必需基因数据库/必需基因的研究方法比较基因组学大规模基因失活实验基于代谢网络的预测方法基因组精简研究方法基于自杀质粒的同源重组方法基于线性DNA的同源重组方法基于位点特异性重组酶的方法基于转座子的方法大肠杆菌删除了29.7%的基因后仍然能够生存谷氨酸棒状杆菌删除188个非必需基因后存活是否存在相对于所有物种通用的最小基因组？在比较基因级学研究中，当物种及其环境多样性足够大时，人们所获得的最小基因组的基因数为0，即并不存在所有物种必需基因的交集。某些生命必需的功能，在不同物种中由非同源的基因所编码，在序列上几乎没有相似性；在同一物种中也可能由多个基因发挥同一功能，其中一个基因的失活不能导致细胞的死亡，因此可能被误认为非必需基因。理论上，通用最小基因组概念的前提是所有生命起源于一个“最晚出现的共同祖先”，即所有遗传信息起源于同一套基因组。然而，事实上是一个初始细胞群体，分别是古生菌、真细菌和真核生物的遗传基础。以必需基因的集合作为最小基因组，那么最小细胞只能在最优条件下生存，而不能持续生存，尤其是当环境条件有所波动的情况下。人工合成脊髓灰质炎病毒

（poliovirus）已知最简单的、可增殖的基因系统。单股正链RNA病毒病毒侵入细胞后，RNA在病毒蛋白、RNA依赖的聚合酶及其他相关蛋白的帮助下，转录为负链以此为模板合成新的病毒基因组。T7RNA聚合酶启动子在无细胞培养液中翻译并复制，最终重新装配成具有侵染能力的脊髓灰质炎病毒。与病毒基因组RNA互补的cDNA合成基因组控制的ΦX174噬菌体自然界的ΦX174的基因序列共有5386个碱基对、11个基因LCR与PCA相结合的方法设计并化学合成寡核苷酸利用LCR与PCA相结合的方法，使核苷酸精确合成5～6kb的DNA片段将合成的基因组DNA注入宿主细胞虽然试验仅涉及简单的生物系统的合成，但该项成果提供了快速且精准合成较长DNA的能力，为操作较复杂生命体奠定了基础。重构T7噬菌体专一的感染大肠杆菌的溶解性噬菌体T7噬菌体侵染的计算机量化仿真模型计算机模拟与实验结果严重失配△模块化改造不改变基因组外部功能改善内部结构、质量和性能去除基因的重叠性和多效性重构后的T7噬菌体被命名为T7.1噬菌体。重新注释野生型噬菌体T7基因组确定功能片段的边界：开放阅读框、操纵元件等。限制性酶切位点蓝色：编码区域紫色：RBS粉色：RNaseIII识别位点黄色：转录终止子灰色：其他将含有39977个碱基对的T7噬菌体基因组划分为73个单元每个单元包含一个或多个元件这73个单元的边界和区域内部均不能出现编码重叠。基因3的RBS与基因2.8有部分重叠复制重叠部分，用编号为28和29的基因元件将其分开大写字母为被替换碱基，替换后的基因序列并未改变该基因表达蛋白质的氨基酸序列。重新注释野生型噬菌体T7基因组确定功能片段的边界：开放阅读框、操纵元件等。元件序列之间不重复；各个元件只编码自己的序列，不具有其他的功能；每个元件可以独立和准确地操作；能够指导新的噬菌体存活。GenomeCalligrapher:AWebToolforRefactoringBacterialGenomeSequencesfordeNovoDNASynthesis重构1918年西班牙流感病毒构建含有西班牙流感病毒株所有8个基因的重构病毒埋葬的流感死者肺组织——5个基因全基因组分析——3个基因应用反射遗传学方法及技术重构病毒注入细菌组合完整病毒基因组将病毒基因组注入人或动物的细胞内，生成病毒蛋白质人造基因组控制的活细胞支原体是目前发现的最小、最简单的具有自我繁殖能力的细胞，其基因组也是原核生物中最小的，因此支原体成为合成生物学研究的较佳对象。将合成的基因组进行甲基化修饰将构建好的人工合成基因组移植入受体细胞内细胞经过不断分裂传代，具有人造基因组的细胞在培养基中筛选出来，含有天然DNA的细胞的逐渐消失，最终只剩下由合成DNA控制的人工嵌合体细胞。合成细胞即使受体细胞的细胞质并不是合成的，因为细胞质表型被蛋白质和携带的合成基因组所稀释，构建的由化学方法合成的DNA片段装配的基因组控制的细胞也可以称为合成细胞。在之后复制形成克隆，其后代将不会带有任何的原始受体细胞的蛋白质分子。嵌合基因组细胞重组有活性的蝙蝠严重急性呼吸综合症（severeacuterespiratorysyndrome，SARS）样冠状病毒转化生殖支原体教学大纲掌握：细胞群体系统脉冲发生器，利用逻辑运算构建多细胞工程网络模块，环境治理，大肠杆菌成像系统了解：群体感应，程序化图案生成系统，维护健康合成多细胞系统（multicellularsystem）单个细胞——其它细胞的作用多细胞协同运作多细胞生命体

基础研究应用△※△※基础研究（1）群体感应（2）细胞群体系统脉冲发生器（3）人工多细胞系统程序化图案生成系统（4）利用分配运算构建多细胞工程网络模块△※（1）群体感应（quorumsensing，QS）细胞浓度达到一定阈值后，细胞的基因表达情况受细胞密度调控的机制。是多细胞系统发展的早期调控步骤之一。细胞群体受群体感应现象的制约。用于系统群体细胞之间的同步响应通过小分子的扩散实现了细胞群体间的通讯与协作在控制细菌致病性中起重要作用将费氏弧菌中响应群体感应的基因分别植入两种独立的细胞中。发生细胞接受细胞人工调控细胞群体浓度利用信号感应系统控制细胞凋亡来调控细胞群体浓度的基因线路。（2）控制群体数量（populationcontrol）的功能基因线路细胞增长细胞凋亡（apoptosis）信号分子当信号分子浓度达到或超过阈值后，LuxR与AHL结合，并启动启动子PluxI融合基因检测融合蛋白的表达量引起细胞凋亡细胞密度此环境下可能达到的最大细胞密度CcdB蛋白的浓度细胞生长速率常数细胞死亡速率常数信号分子AHL的浓度CcdB生成速率常数CcdB降解速率常数AHL生成速率常数AHL降解速率常数细胞自然生长的logistic模型细胞凋亡的速率

稳定状态下Quorum-sensingcrosstalk-drivensyntheticcircuitsfromunimodalitytotrimodality细胞群体系统脉冲发生器（pulser）脉冲对于连续信号在整个信号周期内短时间发生的信号，大部分信号周期内没有信号。像人的脉搏一样。在短时间内突变，随后又迅速返回其初始值的物理量。△细胞群体系统脉冲发生器依据遗传线路对信号浓度随时间变化的响应构建的一种包含脉冲信号的合成细胞群体系统。含有具有前馈调节能力的脉冲发生器遗传线路没有细胞间的通讯和交流脉冲发生细胞产生应答，表达GFP和CI持续传播的AHL信号导致CI浓度超过临界值，对GFP的表达产生抑制发生器细胞随着GFP的降解，荧光消失发生器细胞向脉冲发生细胞发出AHL信号aTc不同AHL浓度不同AHL增长速度脉冲的最大振幅和时间不仅依赖于诱导物的最终浓度，还与诱导物的浓度增长速率有关。（3）人工多细胞系统程序化图案生成系统距离近，过高浓度的AHL过表达CI蛋白和LacIM1蛋白，LacIM1蛋白抑制荧光蛋白的启动子距离适当，适量的AHL引起适量的CI蛋白和LacIM1蛋白的表达。CI对下游启动子的抑制作用使lacI基本不表达，LacIM1基因表达的量不足以抑制下游荧光蛋白的启动子距离远，过少的AHL无法开启足量的CI蛋白和LacIm1蛋白，无法抑制下游基因，使lacI基因表达，产生的LacI蛋白抑制荧光蛋白的表达利用逻辑运算构建多细胞工程网络模块类似于逻辑门等单细胞遗传线路，细胞群体系统及多细胞系统的交流、通讯及功能执行，也可通过使用逻辑运算设计工程化模块加以实现。※NOTIDENTITYANDNANDORNORimplies:(!x)||yN-IMPLIES外源输入其他信号分子可扩散的输入分子输入信号引发产物生成的信号具有抑制作用的信号输出产物扩散性的信号分子目标产物脱氧土霉素NOT报告细胞，用来在活性菌体实验中进行定量分析工程复合线路应用（1）环境治理：砷离子的检测（2）维护健康：癌症治疗（3）大肠杆菌成像系统△※（1）环境治理：砷离子的检测水质的检测氢化物原子吸收光谱法有针对性的检验砷的方法Gutzeit砷检测法这些方法普遍存在分析时间长、误差大、费用昂贵、不易维护等缺点。最重要的是，检测的灵敏度过低。以微生物作为监测器，利用pH的变化作为砷离子存在与否的信号，以检测水中的砷含量。该方法不仅具有成本低的优点，并且检测灵敏度较高。环境中只有乳糖而无砷离子时乳糖与LacI结合，解除其对启动子4的抑制启动子4启动尿素酶基因表达产生尿素酶，催化尿素转化为氨和二氧化碳，碱性增加环境中砷浓度较低时砷离子与ArsR结合，解除对启动子2的抑制λcI表达，产生CI蛋白抑制启动子4，关闭尿素酶基因的表达，没有酸或碱的产生环境中砷离子浓度较高时解除对启动子1的抑制lacZ编码的β-半乳糖苷酶催化乳糖发酵，分解为乙酸和乳糖酸，酸性增加砷离子与ArsD结合（2）维护健康：癌症治疗通过分别取自假结核菌的inv基因和五鲵的lux操纵系统、fdhF启动子和阿拉伯糖操纵子融合，构建了pAC-LuxInv质粒，使大肠杆菌细胞能选择性地在高细胞密度、低氧微环境和化学诱导后具有入侵肿瘤的能力。如果在入侵之后能利用可执行方案调节好大肠杆菌与人类细胞的相互协调关系，不引起免疫反应等不良后果，并且使大肠杆菌具有释放或者催化合成某种可杀死癌细胞的物质，那么靶向治疗癌症、引起最小的副作用将成为可能。（3）大肠杆菌成像系统一个细菌系统，包括感光和显影两大子系统，可以由红光触发该系统在不同状态之间开关。当接收一类光投射到菌体后，可产生高清晰度的二位化学图像。教学大纲掌握：无细胞合成生物系统中蛋白质合成的机制和优越性了解：原核表达系统，真核表达系统，结构蛋白质组学，高通量筛选和功能蛋白质组学，蛋白质进化，对蛋白质进行特殊标记无细胞（cell-free）合成生物系统蛋白质生物合成——核糖体tRNA、蛋白质折叠加工必需的酶和各种相关因子——各种细胞的裂解液RNA模板、氨基酸和能量——提供外源其他的细胞结构——无需无细胞合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板，利用细胞抽提物的酶系，通过添加氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物质等来表达蛋白