生物芯片技术和其发展省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

生物芯片技术及其发展第1页生物芯片定义生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相载体上高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织微点阵(microarray）。生物芯片包含DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未来十年最具发展潜力技术。第2页特点高度并行性：提升试验进程、利于显示图谱快速对照和阅读。多样性：可进行样品多方面分析，提升准确性，降低误差。微型化：降低试剂用量和反应液体积，提升样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，确保质量。第3页生物芯片分类还未统一。广义上：矩阵型芯片、处理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片第4页研究历史1991Affymatrix企业StephenFodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNAChip概念Stanford大学Brown试验室：预先合成，机械手阵列1995Schena等：基因表示谱1996Cheeetal：DNA测序1996Croninetal：突变检测1996Sapolsley&Lipshutz：基因图克隆1996Shalonetal：复杂DNA样本分析1996Shoemakeretal：缺省突变定量表型分析第5页分类（依据应用）基因变异检测芯片疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)法医判定(如DNA指纹图谱)表示谱芯片肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表示差异)药品筛选(培养细胞药品刺激前后表示差异)发育(同一组织不一样发育时期基因表示差异)组织发生(不一样组织或器官基因表示差异)第6页分类（依据工艺和载体）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片载体需表面紧质、光滑固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片惯用玻片为载体。第7页分类（依据DNA成份）寡聚核苷酸或DNA片段：约2025个核苷酸碱基，惯用于基因类型分析，如突变、正常变异（多态性）。全部或部分cDNA：约5005000个核苷酸碱基，通惯用于两种或以上样本相关基因表示分析。第8页基因芯片种类ScienceChip：生物分析和诊疗。NutriChip：食物分析、转基因、污染检测。LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析。AquaChip：水质分析。SecureChip：含DNA物质判定。ChromoChip：基因分析和染色体序列。ProkaryoChip：原核生物、兽医、环境保护等。第9页生物芯片技术主要步骤芯片制备：微点阵样本制备：DNA提纯、扩增、标识杂交：样本与互补模板形成双链检测：共聚焦扫描，双色激光数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。结果

第10页生物芯片分析1、测定过程应包含五个基本步骤：需处理生物学问题样本制备生物化学反应检测数据分析第11页2、生物学系统控制必须准确地与检测目标相匹配。

3、生物学样本必须准确地与生物学种类相匹配。

4、全部基因分析必须平行处理。

5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。

6、平行格式必须准确依据生物学样本次序。

7、检测系统必须能准确地取得数据。

8、检测系统取得数据必须能被准确地控制和重复。第12页9、两种或以上平行数据组比较应受到单

个试验所固有特征限制。

10、绝对百分比关系只存在于组合试验平

行数据组内。

11、平行格式包含内在和外部整个系统

误差分析原因。

12、在每个系统模块中采集到该系统全部

变量四维数据时，才能称为完成生

物系统平行基因分析。

第13页生物芯片技术12条标准只是一个基本框架。其术语详细定义和相关理论可参见

/~schena/

/第14页芯片制备原位合成法（insitusynthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适合用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是当前制造高密度寡核苷酸最为成功方法。合成后交联（post-syntheticattachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过玻片或其它材料上。主要用于诊疗、检测病原体及其它特殊要求中、低密度芯片制备。第15页两种制备方法比较原位合成：测序、查明点突变高密度、依据已知DNA编制程序制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列合成后交联：比较分析制备方式直接和简单，点样样品可事先纯化，交联方式多样，可设计和制备符合自己需要芯片。中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存大量样品。第16页杂交是芯片技术中除方阵构建外最主要一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。选择杂交条件时，必须满足检测时灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能确保每条探针都能与互补模板杂交。适当长度DNA有利于与探针杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。第17页样本制备制备高质量样本是困难但又是极其主要。制备细胞、组织或整个器官样本应尤其小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成份等轻微改变都会使基因表示结果发生显著改变。用于基因类型分析样本是DNA，用于表示研究样本是cDNA。样本制备后应进行标识，通常为酶标识、荧光标识和核素标识。第18页结果分析

芯片与标识靶DNA或RNA杂交后，或与标识靶抗原或抗体结合后，可采取以下方法分析处理数据：共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。质谱法：快速、准确，可准确判断是否存在基因突变和准确判断突变基因序列位置。探针合成较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷改变检测等。第19页芯片扫读装置依据采取光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。依据激光光源，可分为激光型和非激光型。应用最为广泛是激光光源共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好定位功效，可定量，应用广泛。第20页图象分析复杂杂交图谱普通需由图象分析软件来完成。分析软件功效：判定每个点阵、最大程度消除本底荧光干扰、解析各种颜色图象、可标识或排除假阳性、识别和分析对照试验是否成功、可将信号标准化等。图象处理软件必须具备提取基因库和数据库能力。第21页质量控制试验对照：体外转录从cDNA合成mRNA，参入标本中作为对照。此mRNA不与点阵核酸杂交。将不一样浓度不一样基因参入标本中，可作为标本间标准化参考。用两种不一样吸收光谱荧光素同时分析两个标本，假如两种荧光强度一致，可排除标本间变异原因。用单一碱基错配寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。

第22页结果有效性证实在表示矩阵上，有时难于区分极其相同序列，如基因族组员，亚类或异类存在。比较两种不一样DNA序列表示水平时，有些参数如核苷酸成份、二级结构存在和矩阵上DNA长度都会影响杂交。证实矩阵分析结果可用RT-PCR(区分基因族组员,比较不一样DNA种系表示,证实基因变异或突变和准确测定DNA表示水平)、NorthernBlot(证实某一基因相对表示水平)、WesternBlot(RNA表示是否到达细胞中蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。第23页生物芯片技术应用基因表示分析：肿瘤基因突变检测：遗传性疾病测序、基因图绘制和多态性分析：测序微生物菌种判定：毒力基因、抗药基因药品研究：新药筛选、指导合理用药克隆选择及文库筛选第24页生物芯片技术发展发展趋势微型化：DNA矩阵越来越小。集成化：矩阵上基因组越来越大。多样化：测定范围越来越广。微量化：测定所需样本越来越少。全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。定量化：如激光捕捉技术，显微解剖技术等可准确测定一个细胞内一个基因表示。DNA矩阵数据信息库完善。第25页生物芯片技术发展技术毛细管电泳芯片技术PCR芯片技术(PCR-Chip)缩微芯片试验室(lab-on-a-chip)微珠芯片技术(beadArray)抗体和蛋白质阵列技术(Antibodyandprotein-arraytechnology)自我定制芯片技术（makeyourownchip)血气分析芯片第26页毛细管电泳芯片技术Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列测定。宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊疗杜鑫-贝克肌萎缩多条DNA片段。瑞士Ciba-Geigy企业和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸分离。第27页缩微芯片试验室在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示全部过程，结果地从混有大肠杆菌血清中分离出了细菌。含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合芯片。LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性“未来型掌上试验室”构想。第28页抗体和蛋白质阵列技术蛋白质组学(protiomics)兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术发展。PareickBrown使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不一样蛋白质。Leuking等采取蛋白质微阵列技术，测定了10pg微量蛋白质，并证实假阳性极低。第29页乳腺癌基因芯片第30页Stanford乳腺癌微矩阵(Perouetal.1999)每种基因数据以行表示，每个试验用列表示。颜色强度表示对照和试验cDNA比率。比率相同时为1。结果为红色表示mRNA增加，绿色表示降低，灰白色表示缺乏。两种基因相同性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。第31页DNA微矩阵分析软组织肉瘤表示

KavineMaillardetal(1999)cDNAs进行DNA表示矩阵，PCR产物包被在经赖氨酸处理玻片上，用Cys3-和Cys5-标识cDNA进行杂交，洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵，表示数据储存在ACeDB数据库中，依据数据表示类型区分不一样基因。第32页微矩阵分析DNA和蛋白表示

HolgerEickhoffetal.(1999)依据已经有序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表示分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标识人组织RNAs与被选38000人基因片段矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织图象，用软件分析点识别和点定量。使用寡聚核苷酸判定新cDNA克隆，和进入表示载体，使对应蛋白能直接表示，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA关系。第33页生物芯片相关仪器点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。杂交仪：全自动完成调整、加探针、漂洗和热循环杂交过程。扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。第34页微矩阵仪器介绍QBotQPixQArrayQPetQSoft第35页第36页QBot超高解析基因筛选暨排列分析仪。基因菌落筛选(ColonyPicking)：3500/h基因排列打点(Gridding)：100000/h基因复制(Replication)：96

96,96

384基因重新排列(Re-Arraying)：正确基因置复制盘基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：0/片全自动液体分注系统(LiquidHandling):96针，注液量1200l，适合PCR产物。分析软件：分析、质控、上网。环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板第37页第38页QPix半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型)基因菌落筛选(ColonyPicking)：3500/h基因排列打点(Gridding)：100000/h基因复制(Replication)：96

96,96

384基因重新排列(Re-Arraying)：正确基因置复制盘基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：0/片分析软件：分析、质控、上网环境控制：紫