T-SATA 078-2024 血清中26 对手性氨基酸的测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS03.080.99CCSX00血清中26对手性氨基酸的测定Determinationof26chiralaminoacidsinserum—HighperformanceliquidchromatographytandemmasssIT/SATA078—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 25试剂与材料 26仪器和设备 37分析步骤 38结果计算 59灵敏度、精密度 5附录A（资料性）26对手性氨基酸标准品信息 6附录B（资料性）26对手性氨基酸及内标物的定量定性离子对及碰撞能量、碎裂电压 8附录C（资料性）26对手性氨基酸及14种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图 附录D（资料性）26对手性氨基酸的检出限、定量限 参考文献 T/SATA078—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由深圳市计量质量检测研究院提出。本文件由深圳市分析测试协会归口。本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院、深圳市龙岗中心医院、深圳深检集团医学检验实验室、四川大学、南方科技大学医院、深圳市人民医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、深圳市龙岗区妇幼保健院、深圳恒生医院。本文件主要起草人：肖伟敏、张玉鑫、王奇、孙亮、李子樱、杨国武、赵云霞、陈欣、陈佳平、王奇、罗敏、于建渤、李博、李小峰、李永新、袁小澎、赵洪悦、纪昕、于波海、周珍文、张光辉、匡慧1T/SATA078—2024血清中26对手性氨基酸的测定高效液相色谱-串联质谱法本文件规定了血清中26对手性氨基酸（L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L鸟氨酸、L-瓜氨酸、L-羟基脯氨酸、L-α-氨基己二酸、L-正缬氨酸、L-犬尿氨酸、L-2-氨基丁酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-脯氨酸、D-缬氨酸、D-苏氨酸、D-半胱氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-色氨酸、D-赖氨酸、D-鸟氨酸、D-瓜氨酸、D-羟基脯氨酸、D-α-氨基己二酸、D-正缬氨酸、D-犬尿氨酸、D-2-氨基丁酸、D-甲硫氨酸和D-酪氨酸）的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于血清中26对手性氨基酸的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T32465-2015化学分析方法验证确认和内部质量控制要求WS/T478-2024血清25-羟基维生素D2和D3的检测同位素稀释液相色谱串联质谱法WS/T225-2024临床化学检验血液标本的采集与处理WS/T661静脉血液标本采集指南WS/T408-2024定量检验程序分析性能验证指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1内标internalstandard在定量分析时，加入到样品中作为参比物的已知量的化合物纯品。3.2检出限limitofdetection检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。3.3定量限limitofquantification在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分析物的最低可测量浓度或量。3.4线性linearity在给定的测量范围内，使测定结果与样品中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最终的分析结果，而非仪器输岀的原始信号。2T/SATA078—20243.5线性范围linearrange使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。3.6基质效应matrixeffect标本中除分析物之外的样品性质对分析物测定结果的影响。4原理试样经10%磺基水杨酸溶液沉淀蛋白后，得到游离的氨基酸，采用1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺（FDAA）Marfey衍生试剂在37℃的碱性条件下，不经外消旋，与L-和D-氨基酸的α-氨基反应生成非对映异构体后用高效液相色谱-串联质谱测定，标准曲线内标法定量。5试剂与材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1乙腈（C2H3N）：质谱纯。5.1.2甲酸（CH2O2）：质谱纯。5.1.3磺基水杨酸（C7H6O6S）：分析纯，CAS号：5965-83-3。5.1.41-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺（C9H9FN4O5，FDAA），CAS号：95713-52-3。5.1.5盐酸（HCl），色谱纯。5.1.6三乙胺（C6H15N），色谱纯。5.1.7醋酸（CH3COOH），色谱纯。5.1.8乙酸铵（CH3COONH4），质谱纯。5.1.9丙酮（CH3COCH3），分析纯。5.2试剂配制5.2.10.1%甲酸水溶液：准确吸取甲酸（5.1.2）50.0μL于50mL容量瓶中，定容至刻度。临用现配。5.2.210%磺基水杨酸水溶液：准确称取2.50g磺基水杨酸（5.1.3）用一级水溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，室温保存3个月。5.2.33mg/mLFDAA衍生试剂：准确称取30.0mgFDAA（5.1.4）用丙酮溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，临用现配。5.2.40.1mol/L盐酸水溶液：准确吸取556μL盐酸溶液（5.1.5）于100mL容量瓶中，用一级水定容至刻度，4℃保存3个月。5.2.50.5mol/L三乙胺溶液：准确称取5.06g三乙胺用甲醇溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，避光室温保存3个月。5.2.60.5mol/L醋酸溶液：准确称取3.00g醋酸用一级水溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，室温保存3个月。5.2.710mmol/L乙酸铵水溶液：准确称取0.77g乙酸铵用一级水溶解并转移至1L容量瓶中定容至刻度，临用现配。5.3标准品L-/D-氨基酸标准物质及稳定同位素内标物，纯度大于或等于95%或有证标准物质，26对L-/D-氨基酸中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量等详见附录A。5.4标准溶液配制3T/SATA078—20245.4.1外标标准储备液（2000μg/mL）：分别准确称取0.200g（精确至0.0001g）各标准品用一级水溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，4℃避光保存，保存期为3个月。5.4.214种稳定同位素内标标准储备液（200μg/mL分别准确称取0.020g（精确至0.0001g）各标准品用一级水溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。4℃避光保存，保存期为3个月。5.4.3外标混合标准中间液（10μg/mL)：准确移取125μL各外标标准储备液（5.4.1）于25mL容量瓶，用一级水定容至刻度。4℃避光保存，保存期为3个月。5.4.4内标混合标准中间液（10μg/mL)：准确移取500μL稳定同位素内标标准储备液（5.4.2）于10mL容量瓶中，用一级水定容至刻度。临用现配。5.4.5外标混合标准工作液（4μg/mL）：准确移取4mL外标混合标准中间液（5.4.3）至10mL容量瓶中，用一级水定容至刻度。临用现配。5.4.6内标混合标准工作液（4μg/mL）：准确移取4mL内标混合标准中间液（5.4.4）至10mL容量瓶中，用一级水定容至刻度。临用现配。6仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配置电喷雾电离源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3涡旋混合器。6.4恒温水浴锅。6.5离心机：转速不低于18000r/min。6.6超声机。7分析步骤7.1样品前处理a)量取100μL待测血清，加入100μL内标混合标准工作液（5.4.6）；b)加入10μL10%磺基水杨酸水溶液（5.2.2），涡旋混匀60s；c)加入290μL0.1%甲酸水（5.2.1），涡旋均匀后，4℃超声15min；e)取上清液50μL进行衍生，衍生时依次加入100μL3mg/mLFDAA试剂（5.2.3）、50μL0.5mol/L三乙胺（5.2.5），涡旋混匀后置于37℃恒温水浴锅水浴16h；f)水浴结束后加入50μL0.5mol/L醋酸（5.2.6）终止衍生，涡旋混加入150μL10%乙腈水稀释后涡旋混匀，离心（4℃,18000r/min）15min，取100μL上清液供LC-MS/MS分析。28天，可根据实际情况进行符合要求的相应调整。使7.2仪器参考条件7.2.1液相条件a)色谱柱：五氟苯基柱，或相当者；b)流动相：乙腈和10mmol/L乙酸铵水溶液；c)流速：0.5mL/min；e)样量：1µL；f)洗脱梯度见表1。表1超高效液相色谱洗脱梯度参考条件4T/SATA078—2024007.2.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)检测方式：多反应监测（MRM）；c)扫描方式：负离子模式；d)毛细管电压：负离子模式：5500V；e)离子源温度：350℃;f)气帘气：30psi；g)喷雾气：40psi；h)辅助加热气：40psi；i)碰撞气：9psi；j)监测离子对和定量离子对等信息详见附录B；26对L-/D-氨基酸及14种内标物的多反应监测（MRM）质量色谱图详见附录C。7.3标准曲线的制作用0.1%甲酸水溶液（5.2.1）、4μg/mL外标混合标准工作液（5.4.5）、4μg/mL内标混合标准标准系列工作溶液中各内标的浓度为100ng/mL。配置完成后取50μL标准溶液进行衍生步骤同7.1衍生方法。将衍生后标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以26对手性氨基酸与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以标准系列工作液浓度（ng/mL）为横坐标，分别绘制26对手性氨基酸的标准曲线。不同物质根据实际情况采用不同范围的标准曲线。7.4定性和定量7.4.1保留时间被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。7.4.2离子丰度比按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对离子丰度。表2定性时离子丰度比的最大允许偏差7.4.3试样溶液的测定5T/SATA078—2024将处理完毕的试样（7.1）按仪器参考条件（7.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。8结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：式中：X——试样中各待测物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mLc——从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV1——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2——取样体积，单位为毫升（mLK——稀释倍数。结果保留三位有效数字。9灵敏度、精密度9.1灵敏度各氨基酸的定量限及检出限见附录D。9.2精密度依据已发布的行业标准等规范性文件，对方法的精密度进行验证，定量检测下限浓度附近低值CV6T/SATA078—2024（资料性）26对手性氨基酸标准品信息26对手性氨基酸标准品信息见表A.1。表A.126对手性氨基酸标准品信息1CHNO2CHNO3CHNO4CHNO5CHNO6CHNO7CHNO8CHNO9CHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOSCHNOSCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNO7T/SATA078—2024CHNOCHNOCHNOCHNOCHNOCHNOSCHNOS8T/SATA078—2024（资料性）26对手性氨基酸及内标物的定量定性离子对及碰撞能量、碎裂电压26对手性氨基酸及内标物的定量定性离子对及碰撞能量、碎裂电压见表B.1。表B.126对手性氨基酸及内标物的定量定性离子对及碰撞能量、碎裂电压1234567899T/SATA078—2024L-天冬氨酸-CL-丙氨酸-CL-丝氨酸-C,NL-天冬酰胺-NL-天冬氨酸-NL-谷氨酰胺-NL-谷氨酸-C,NL-精氨酸-NL-色氨酸-C,NL-赖氨酸-N注：带为定量离子。对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。T/SATA078—2024（资料性）26对手性氨基酸及14种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图T/SATA078—2024T/SATA078—2024T/SATA078—2024图C.126对手性氨基酸及14种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图T/SATA078—2024（资料性）26对手性氨基酸的检出限、定量限26对手性氨基酸的检出限、定量限见表D.1。表D.126对氨基酸的检出限、定量限123456789T/SATA078—2024T/SATA078—2024参考文献[1]Wu,S.,Ye,Q.,Wu,D.,Tao,Y.,&Kong,Y.(2020).Enantioselectiverecognitionofchiraltryptophanwithachiralglycin