T-CVMA 181-2024 猫杯状病毒感染诊断技术规范

T/CVMA181—2024猫杯状病毒感染诊断技术规范TechnicalSpecificationfordiagnosisoffelinecalicivirusinfection2024-9-9发布2024-9-9实施中国兽医协会发布I12规范性引用文件GB19489实验室生物安全通GB/T27401实验室质量控制规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范FCV：猫杯状病毒（FelineCaliciviruPCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactioCt值：循环阈值（Cyclethresh26.1.1患猫发病前不久接触过FCV病猫或无症状感染猫或患病猫使6.1.2患猫发病前有过生活环境的6.1.3收容所、猫舍等群养猫中出现了群发性呼吸道疾病，尤其在新引进猫后，未6.1.4流浪猫或户外活动的猫发生呼吸道6.2.3少数病例出现跛行，面部、足部出现脱毛、水肿、溃疡，脱水、死亡中的一随即密封，即完成采样，编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时添加冰袋8.1.2高速台式冷冻离心机。38.1.3生物安全柜。8.3.4病毒核酸提取试剂盒。8.6RNA反转录选用商品化反转录试剂盒，按照试剂盒说明，将提取的RNA反转录为cDNA，cDNA直接用于PCR取8.6步骤反转录的cDNA，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及参数见附录8.8.1样品制备：分别取样品PCR扩增8.8.2加样：分别取10μLDNAMar8.8.3电泳：5V/cm恒压下电泳30min，将凝胶置于凝胶成像系统中观48.9.2阴性对照：PCR产物无核酸条带。9猫杯状病毒荧光PCR检测9.1仪器9.4.2加样），），反应管对应的样品编号，盖紧管盖后，500合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。9.4.4结果判定确定阈值质控标准5可疑出现6.1和6.2中的任一项，且经猫杯状病毒PCR检测或猫杯状病毒荧光PCR检测核酸阳性，可诊断6试剂配方称量Tris24.2g，Na2EDTA·2H2O3.72g于1L烧杯中。向烧杯中加入约600mL无菌蒸馏水，充分搅称量Tris54.0g，EDTA2.9mg于1L烧杯中。加入硼酸27.5g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。A.3核酸凝胶制备7引物序列5’-3’NS1-PCR-FNS1NS1-PCR-R注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC水溶解并稀释至终浓度10µmol/L,-20℃保存备用。注2：扩增目的片段长度452bp，针对FCVNS体积(µL）2×Taq酶\NS1-PCR-FNS1-PCR-R\2\7\118FCV-FNS1FCV-RFCV-PFAM-CCGCCAATCAACATGTGGTAA-BHQ注1：引物由生物公司合成，纯度为HPLC级，用商品化DEPC水溶解并稀释至终浓度10µmo工作液终浓度(μmol/L）加样体积(µL）\酶\FCV-F0.48FCV-R0.48FCV-P0.16\2\\2min1195’-GAATTGGCTAAGATCTTACATGAAGAAATCAAAGTTTACACACTAAACCCACATACAACCCAATTTTAAGAAATCTAATGTCAACTCTTGACGGGGTCATTACATCACGGAAAGCTGTGGCAAGGAAGAGGCAGGTTCCAGTGTGTTACATCCTGTGGGAAAACAACAGCCGCCCATGCGCTTGCAAAGAAATTATCCGACCAAGACAAACTTGGATGTGGACCATCATGACACATATACCGGAAATGAAGTGTGCATTGTCGATGAGTTTGACTCATCTGATAAAGTGGAtTTTGCAAATTTTGTTATTAGTATGGTTAATTCTGCACCAATGATCCTAAATTGTGACATGCTTGAAAACAAAGGGAAGCTTTTCACCTCTAAGTACATTATTATGACTTCTAATTCTGAAACCCC-3’AAGAAGTTCGTTGTAACACGTTGCAACTCGGTGTTTGATTTGGCCTGGGCTCTTCGCCGACATCTGACTTTGGCAGGG质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/µL=[6.02×1023×DNA浓度（