植物细胞工程的基本技术课件-高二下学期生物人教版选择性必修32

选择性必修3第2章

细胞工程1.细胞工程的概念

细胞工程（cellengineering)是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞或细胞器的水平上的操作，有目的地获得特定的细胞或组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。（1）原理和方法：细胞生物学和分子生物学（2）操作水平：细胞或细胞器（3）目的：获得特定的细胞或组织、器官、个体或其产品。细胞工程的概述2.细胞工程分类（1）依据操作对象分：植物细胞工程和动物细胞工程

（2）依据操作技术分：植物组织培养技术、细胞融合技术、动物细胞核移植技术等。3.植物细胞工程类型植物组织培养植物体细胞杂交4.动物细胞工程类型动物细胞培养动物细胞融合动物细胞核移植细胞工程的概述1902年：哈伯兰特提出细胞全能性的理论，但相关实验尝试没有成功。植物细胞工程的发展历程1958年：斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。1960年：科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。1964年：古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。1971年：卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。1974年：土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。¦

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¦动物细胞工程的发展历程1890年：希普首例胚胎移植成功。1958年：格登、童第周：体细胞核移植成功。2006年：山中伸弥获得诱导多能干细胞。1959年：试管家兔诞生。2014年：单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生。1996年:克隆羊多莉诞生。1978年：胚胎分割移植成功。1907年：哈里森:首创动物组织体外培养法。1951年：张明觉发现哺乳动物精子获能现象。1975年：米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术。1981年：埃文斯成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。2017年:我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。¦

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¦本节聚焦:植物细胞工程的理论基础是什么？什么是植物组织培养技术和植物体细胞杂交技术？怎样进行菊花的组织培养？选择性必修3/第2章/细胞工程/第1节

植物细胞工程（一）——植物细胞工程的基本技术

“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫花开，凝情瀼露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非真兰室乎！岂非有国香乎！”

——《金漳兰谱》高洁、典雅的兰花颇受人喜欢。但其繁殖率低，价格不菲，如何让它大量、快速地繁殖呢？利用植物组织培养技术可大量、快速地培育兰花一、植物组织培养技术植物细胞的全能性1.概念：细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株受精卵发育成个体（动植物）蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株2.体现细胞全能性的原因：生物体的每个细胞中都含有发育成为完整个体所需的全部遗传物质。细胞全能性实例：——多肉进行叶插繁殖1.选取多肉上健康、饱满的叶片。2.用剪刀切下整片叶片，切口要平滑、整齐。也可以直接用手轻轻掰下叶片。3.平躺放在沙床上，叶片间隔相聚2~3厘米。4.叶片切口不要有碰脏，摆放通风处2~3天，晾干。5.待叶片晾干后移至半阴处养护。6.约2~3周后生根，或从叶基处长出不定芽。7.叶插成功一、植物组织培养技术植物细胞的全能性4.不体现全能性的原因：基因在特定时间、空间条件下选择性表达生物体生长发育过程中并不是所有细胞都表现出全能性！3.不体现全能性的实例：芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶分化程度低的＞分化程度高的。分裂能力强的＞分裂能力弱的。受精卵＞生殖细胞＞体细胞；受精卵＞干细胞＞体细胞植物细胞＞动物细胞。5.细胞全能性大小比较：④不同生物细胞的全能性：——如何才能让细胞表现出全能性？①体细胞全能性与细胞分化程度：②体细胞全能性与细胞分裂能力：③不同类型细胞的全能性:一、植物组织培养技术植物组织培养有丝分裂无性生殖细胞的全能性是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。2.生殖方式：3.分裂方式：4.原理：1.概念：外植体如：茎尖、根尖接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽诱导生根5.过程：一、植物组织培养技术植物组织培养脱分化再分化移栽成活外植体——离体的植物器官、组织、细胞或原生质体。植物的茎尖、幼嫩的叶片、花药是常用的外植体。脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。愈伤组织：细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。

胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的无定形状态的细胞。愈伤组织形成以后，如果在原来的培养基上续培养，就会由于培养基中养分不足或有毒代谢产物的，导致愈伤组织生长停止，甚至老化变黑乃至死亡。如果要愈伤组织续生长增殖，必须定期地将它们分成小，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的再分化主要有两种方式。一种是不定芽方式，就是在某些条件下，愈伤组织的细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根（图1-2-8）。另一种是胚状体方式，就是由愈伤组织诱导分化出的具有胚芽、胚根、胚轴的类似于胚的结构。能够产生胚状体的愈伤组织常见于胡萝卜、芦笋、玉米和小麦等植物。小贴士根、芽植物体脱分化再分化培养条件：①无菌②营养物质③适宜环境条件（温度、PH、光等）④植物激素：

细胞分裂素生长素如：胡萝卜的形成层、菊花幼茎段、月季的花药…植物组织培养技术的过程遮光一定的光照芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照排列不规则，高度液泡化，呈不定型状态的薄壁细胞愈伤组织离体的植物器官、组织或细胞（外植体）愈伤组织重新分化为芽、根等器官失去特有结构和功能转变成未分化的细胞7.影响植物组织再分化的因素有：

①生长素和细胞分裂素的比值②

微生物

③

培养基的离子平衡④pH值

⑤

温度6.植物组织培养的条件：①离体②无菌③培养基④适宜的外界条件生长素含量＞细胞分裂素时，主要诱导根原基的形成，反之，主要诱导芽原基的形成。一、植物组织培养技术植物组织培养菊花的组织培养实验原理：1.植物细胞一般具有___________；3.植物激素中__________和______________是启动___________、_________和_________的关键激素，它们的_______、_______等都会影响植物细胞的发育方向；生长素细胞分裂素细胞分裂脱分化再分化浓度比例全能性2.在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化和再分化，形成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株;细胞分裂素生长素芽分化愈伤组织根分化生长素/细胞分裂素结果比值≈1比值＞1比值＜1促进根的分化促进芽的分化促进愈伤组织的形成高根低芽中愈伤!（1）了解植物组织培养的基本原理（2）了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响。（3）尝试进行植物组织培养目的：材料用具：①外植体：_______________*经常选择根尖（分生区）、茎的韧皮部（形成层）等分裂能力强、分化程度低的区域作为材料，容易诱导形成愈伤组织；②体积分数为70%的酒精

*对手、超净工作台、外植体进行消毒③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液

*对外植体进行消毒④无菌水

*清洗外植体⑤培养基（参见本书附录1）*包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）；*蔗糖的作用：提供能量，调节渗透压*培养基灭菌方法为：___________幼嫩的菊花茎段湿热灭菌法菊花的组织培养菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段3.接种外植体4.诱导愈伤组织5.诱导芽和根6.移栽消毒外植体切段接种外植体诱导愈伤组织诱导芽和根移栽菊花的组织培养方法步骤：1.消毒②消毒：①材料：幼嫩的菊花茎段(外植体)酒精(30S)无菌水(2-3次)次氯酸钠溶液(30min)(2-3次)无菌水洗用酒精擦拭双手和超净工作台面；外植体菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段

将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中→用无菌滤纸吸去表面的水分→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。无菌操作目的：防止杂菌生长。①会与培养物竞争(种间竞争)营养；②产生有害物质危害培养物。菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段3.接种外植体

在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。注意：接种时注意外植体的方向，不要倒插！(形态学上端朝上）菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段3.接种外植体4.诱导愈伤组织

将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。(脱分化)

注意：该过程一般不需要光照，有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织！菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段3.接种外植体4.诱导愈伤组织5.诱导芽和根

培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上→长出芽后→将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。(再分化)注意：每日需要给予适当时间和强度的光照！(光照培养)菊花的组织培养方法步骤：1.消毒2.外植体切段3.接种外植体4.诱导愈伤组织5.诱导芽和根6.移栽

移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。幼苗愈伤组织脱分化CTK/IAA比例适合再分化CTK/IAA比例先增大在减小菊花植物组织培养过程示意图完整植株外植体菊花的组织培养注意事项：①实验中使用的培养基和所有器械都要灭菌，接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌；

②对外植体进行表面消毒时，既要考虑药剂的消毒效果，又要兼顾植物材料对药剂的耐受性；③接种时注意外植体的方向（形态学上下端），不要倒插。思考：1.为什么整个过程要保证无菌操作？2.为什么外植体不能倒插？

避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。与生长素的极性运输有关；生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。脱分化

将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18-22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。*该过程一般不需要光照；*有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。再分化*注意顺序，先诱导生芽，再诱导生根；*该过程每日需要给予适当时间和强度的光照。培养15~20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上长出芽后将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗菊花的组织培养结果分析与评价：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等；

观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。

1.接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。2.你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天?愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？菊花的组织培养结果分析与评价：3.观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等，还可以进行不同配方的比较。4.你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。

避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。1）培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2）外植体的消毒（酒精、氯化汞）3）接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4）无菌箱中的培养；5）移栽到消过毒的环境中生存一段时间。菊花的组织培养结果分析与评价：5.为什么整个过程要保证无菌操作？6.在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？菊花的组织培养结果分析与评价：7、若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？空白对照：不加任何激素实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。

能否从以上内容中概括植物组织培养中细胞表现出全能性所需要的条件？植物组织培养中细胞表现出全能性的条件（1）离体（最关键）（2）严格的无菌条件（3）适宜的培养条件（4）适宜浓度和比例的激素（5）一定的营养条件①对操作环境、双手、外植体进行消毒；②对培养基和器械进行灭菌；③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）；②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。*植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同。*配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、适宜浓度和比例的激素。*若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。特殊的植物组织培养——花药离体培养花药离体培养配子DDTTDDttddTTddtt正常植株（纯合）秋水仙素诱导高杆抗病

DdTtDTDtdTdt单倍体植株DTDtdTdt需要的纯合矮抗品种（1）植物组织培养过程中涉及的分裂方式为_________；（2）该过程涉及的生殖方式是_________*；（3）经秋水仙素加倍之后，获得的植株一般为_______，一定是吗？_______。有丝分裂有性生殖纯合子不一定二、植物体细胞杂交技术×土豆西红柿1.通过有性杂交能实现吗？为什么？不能，不同种物种间存在生殖隔离。植物体细胞杂交技术。2.有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得“番茄-马铃薯杂种植株”呢？【思考讨论】概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。原理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。二、植物体细胞杂交技术过程：A细胞B细胞纤维素酶果胶酶去壁酶解法正在融合的原生质体杂种细胞AB诱融物理法：化学法：电融合法、离心法等聚乙二醇（PEG）融合法等脱分化再分化移栽植物细胞融合植物组织培养杂种植株愈伤组织A原生质体B原生质体移栽后的植株去壁植物细胞融合完成的标志植物体细胞杂交完成的标志（植物细胞的全能性）（细胞膜的流动性）再生细胞壁二、植物体细胞杂交技术意义：打破生殖隔离，实现远源杂交育种注意：1.两个标志：

①融合完成的标志

②体细胞杂交完成的标志——再生新的细胞壁（与高尔基体等有关）——培育出杂种植株2.体细胞融合后，培养基中共有5种类型细胞：A，B，AA，BB，AB3.杂种细胞中染色体数、染色体组数，都采用直接相加504

杂种细胞染色体数为？

杂种细胞染色体组数为？

从杂种植株的染色体组成上看属于何种变异？染色体数目变异A为2N=20

B为2N=30思考讨论：高尔基体

再生新壁过程中的主要细胞器是？二、植物体细胞杂交技术注意：细胞壁细胞膜细胞质液泡细胞核4.区分原生质体和原生质层指的是脱去细胞壁的细胞。包括：细胞膜、细胞质、细胞核。原生质体成熟植物细胞的细胞膜、液泡膜和介于这两层膜之间的细胞质。原生质层【注意】质壁分离的“质”指的是原生质层。5.制备原生质体和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。原生质层6.植物体细胞杂交的方法（1）化学法和物理法（原生质体融合用这两种方法）

化学法：聚乙二醇

优点：使用方便，诱导细胞融合的频率高

缺点：有一定的毒性对某些细胞不适用（如卵细胞）

物