小肽分子修饰对金纳米团簇生物效应的差异化影响探究

一、引言1.1研究背景与意义纳米材料作为“21世纪最有前途的材料”，自19世纪60年代胶体微粒成功研制以来，便开启了科研探索的大门。到20世纪80年代，德国教授成功制备出由粒径为6nm的金属铁粉原位加压而成的纳米材料，此后纳米材料在物理学、化学、环境学、医学等诸多领域广泛应用。金纳米颗粒作为纳米材料中的重要成员，包括金纳米晶体和金纳米团簇，凭借其稳定特性以及独特的光学、电学物理性质、化学性质和催化性能，成为21世纪至关重要的新型发展材料。金纳米团簇是由几个至上千个原子、分子结合成的相对稳定的微观和亚微观聚集体，处于原子、分子和宏观固体之间的新层次，其物理、化学性能既不同于单个原子、分子，也不同于常规固体，是凝聚态物质中的一种新结构。在生物医学领域，金纳米团簇展现出巨大的应用潜力。在化学传感方面，利用其对特定物质的选择性吸附和电子转移特性，可实现对生物分子、金属离子等的高灵敏检测。如对某些疾病标志物的检测，能够为疾病的早期诊断提供依据。在细胞成像中，金纳米团簇具有良好的生物相容性和独特的光学性质，可作为荧光探针，清晰地标记细胞内的特定结构或分子，助力科学家深入研究细胞的生理和病理过程。在生物治疗领域，金纳米团簇可用于药物载体，将药物精准递送至病变部位，提高治疗效果并降低对正常组织的损伤；还能利用其光热效应，实现对肿瘤细胞的光热治疗。小肽分子是由2-50个氨基酸残基组成的生物分子，是蛋白质水解产物中的一类。与大肽和蛋白质相比，小肽分子较小，分子量一般不超过5000，结构相对简单。但小肽具备多种生物活性，如免疫调节、抗菌、抗肿瘤、保肝、抗糖尿病、抗血栓等作用。将小肽分子修饰到金纳米团簇表面，能为金纳米团簇带来新的功能和特性。不同序列和结构的小肽，可赋予金纳米团簇不同的靶向性，使其能够特异性地识别并结合到特定的细胞或组织上，大大提高了金纳米团簇在生物医学应用中的精准性。小肽的生物活性还能与金纳米团簇的特性协同作用，增强其治疗效果或检测灵敏度。比如具有抗菌活性的小肽修饰的金纳米团簇，在抗菌治疗中可能发挥更强大的作用。本研究聚焦于不同小肽分子修饰的金纳米团簇的生物效应，旨在深入探究小肽修饰对金纳米团簇生物效应的影响机制，为金纳米团簇在生物医学领域的进一步应用提供理论基础和实验依据，推动其从实验室研究向临床应用的转化进程。1.2国内外研究现状在国际上，金纳米团簇的研究始于20世纪80年代，当时主要集中在其合成方法和基础物理化学性质的探索。随着研究的深入，到21世纪初，科学家们开始关注金纳米团簇在生物医学领域的潜在应用。例如，美国的一些科研团队率先尝试将金纳米团簇用于细胞成像研究，发现其能够有效地标记细胞，且具有良好的生物相容性。此后，欧洲、亚洲等地区的科研机构也纷纷加入研究行列，使得金纳米团簇在生物医学领域的研究迅速发展。小肽修饰金纳米团簇的研究也逐渐成为热点。国外的研究侧重于利用小肽的靶向性，赋予金纳米团簇特异性识别肿瘤细胞的能力。如美国的研究团队通过将含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的小肽修饰到金纳米团簇表面，成功实现了对整合素高表达肿瘤细胞的靶向成像和治疗。在抗菌领域，有研究将具有抗菌活性的小肽与金纳米团簇结合，发现其对耐药菌具有显著的抑制作用，为解决耐药菌感染问题提供了新的思路。国内对金纳米团簇的研究起步相对较晚，但发展迅速。近年来，国内众多科研团队在金纳米团簇的合成、修饰及应用方面取得了一系列重要成果。在小肽修饰金纳米团簇方面，国内研究更加注重多学科交叉融合，结合材料科学、生物医学工程等领域的知识，开发具有独特功能的小肽修饰金纳米团簇体系。例如，有研究团队利用基因工程技术制备了具有特定功能的小肽，并将其修饰到金纳米团簇上，用于生物分子的检测和疾病的诊断治疗，取得了较好的效果。然而，现有研究仍存在一些不足之处。在合成方法上，虽然目前已经发展了多种制备小肽修饰金纳米团簇的方法，但这些方法往往存在操作复杂、产率低、成本高等问题，难以实现大规模生产和工业化应用。在生物效应研究方面，虽然已经对小肽修饰金纳米团簇在细胞成像、生物治疗等方面的应用进行了探索，但对于其在生物体内的代谢过程、长期毒性以及潜在的免疫原性等方面的研究还不够深入，这限制了其进一步的临床应用。不同小肽修饰的金纳米团簇之间的性能对比研究还不够系统全面，缺乏对修饰小肽的序列、结构与金纳米团簇生物效应之间关系的深入理解，不利于针对性地设计和开发具有优异性能的小肽修饰金纳米团簇。1.3研究内容与方法1.3.1研究内容不同小肽修饰金纳米团簇的制备：采用化学合成法，以氯金酸为金源，通过柠檬酸钠还原法制备金纳米团簇。利用碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）介导的酰胺化反应，将具有不同功能的小肽，如富含精氨酸的细胞穿透肽、具有肿瘤靶向性的RGD小肽、抗菌肽等，修饰到金纳米团簇表面。在反应过程中，精确控制小肽与金纳米团簇的摩尔比、反应温度和时间等条件，以确保小肽能够稳定且有效地修饰到金纳米团簇上，制备出一系列不同小肽修饰的金纳米团簇。小肽修饰金纳米团簇的表征：运用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM），观察金纳米团簇的粒径大小、形态以及小肽修饰后金纳米团簇的整体结构，获取其微观结构信息。通过X射线光电子能谱（XPS）分析，确定金纳米团簇表面元素的组成和化学状态，明确小肽与金纳米团簇之间的结合方式和化学键的形成情况。采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征，检测小肽修饰前后金纳米团簇表面的官能团变化，进一步验证小肽的成功修饰。利用动态光散射（DLS）技术，测量金纳米团簇在溶液中的粒径分布和zeta电位，评估其在不同溶液环境中的稳定性。小肽修饰金纳米团簇的生物活性研究：在细胞水平上，选用人肝癌细胞（HepG2）、人乳腺癌细胞（MCF-7）等肿瘤细胞系，以及正常的人肝细胞（L02）、人乳腺上皮细胞（MCF-10A），采用MTT法、CCK-8法等细胞增殖检测方法，研究不同小肽修饰金纳米团簇对细胞生长和增殖的影响。通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡情况，探究其对细胞周期进程和凋亡信号通路的调控作用。在动物水平上，建立小鼠肿瘤模型，将不同小肽修饰的金纳米团簇通过尾静脉注射等方式给予小鼠，观察其对肿瘤生长的抑制效果，利用活体成像技术监测金纳米团簇在小鼠体内的分布和代谢情况，评估其生物安全性和治疗效果。小肽修饰金纳米团簇的生物效应机制研究：利用蛋白质印迹法（Westernblot）检测细胞内相关信号通路蛋白的表达和磷酸化水平，如PI3K/Akt、MAPK等信号通路，深入探究小肽修饰金纳米团簇影响细胞生长、凋亡和增殖的分子机制。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析相关基因的表达变化，从基因层面揭示其作用机制。运用免疫荧光染色技术，观察金纳米团簇在细胞内的定位情况，以及与细胞内特定分子的相互作用，进一步阐明其生物效应的发生过程。1.3.2研究方法文献研究法：全面搜集和整理国内外关于金纳米团簇、小肽修饰以及生物效应等方面的文献资料，包括学术期刊论文、学位论文、专利文献、研究报告等。对这些文献进行系统分析和综合归纳，了解该领域的研究现状、发展趋势以及存在的问题，为本研究提供坚实的理论基础和研究思路。实验研究法：在实验室环境下，严格按照上述研究内容中的实验步骤和方法，进行不同小肽修饰金纳米团簇的制备、表征、生物活性研究以及生物效应机制研究。对实验过程中的各种参数进行精确控制和记录，确保实验结果的准确性和可靠性。采用平行实验和重复实验的方法，减少实验误差，提高实验数据的可信度。数据分析方法：运用统计学软件，如SPSS、Origin等，对实验获得的数据进行统计分析。采用单因素方差分析（One-wayANOVA）、t检验等方法，比较不同实验组之间的数据差异，判断实验结果是否具有统计学意义。通过绘制图表，如柱状图、折线图、散点图等，直观地展示数据变化趋势和规律，便于对实验结果进行分析和讨论。二、金纳米团簇与小肽分子修饰概述2.1金纳米团簇的特性与应用2.1.1金纳米团簇的结构与性质金纳米团簇是由几个至上千个金原子组成的相对稳定的聚集体，尺寸通常在2纳米以下，处于原子、分子与宏观固体之间的特殊尺度范围。这种独特的尺寸赋予了金纳米团簇诸多区别于常规材料的特性。从原子结构来看，金纳米团簇中的金原子以特定的方式排列，形成有序的结构。例如，常见的Au25团簇具有精确的原子组成和结构，其内核由13个金原子组成二十面体，外层则由12个金原子通过硫醇配体连接，形成了稳定的核-壳结构。这种精确的原子排列使得金纳米团簇具有明确的化学组成和结构特征，为其性质的研究和应用提供了基础。金纳米团簇的尺寸效应十分显著。当金纳米团簇的尺寸减小到纳米尺度时，其物理和化学性质发生了明显变化。由于量子限域效应，金纳米团簇的电子能级从连续态分裂为离散的能级，导致其具有独特的光学和电学性质。在光学方面，金纳米团簇表现出强烈的光致发光特性，其发射光谱范围涵盖了从近红外到紫外可见区域。与传统的金纳米颗粒不同，金纳米团簇的吸收和发射光谱具有明显的特征峰，这是由于其离散的能级结构导致的特定波长的光吸收和发射。例如，某些金纳米团簇在近红外区域具有较强的荧光发射，这使得它们在生物成像和光疗等领域具有潜在的应用价值。在电学性质上，金纳米团簇的量子尺寸效应使其表现出与宏观金属不同的导电性和电子传输特性。由于电子的局域化和能级的离散化，金纳米团簇的电子传输受到量子隧穿等量子效应的影响，其电导率和电子迁移率与传统金属材料存在差异。这种独特的电学性质使得金纳米团簇在纳米电子学和传感器等领域具有潜在的应用前景，如可用于制备高性能的电子器件和高灵敏度的传感器。此外，金纳米团簇还具有良好的化学稳定性和生物相容性。金原子之间的化学键以及表面配体的保护作用，使得金纳米团簇在一定的化学环境下能够保持稳定的结构和性质。在生物医学应用中，其生物相容性使得金纳米团簇能够在生物体内相对安全地存在和发挥作用，减少对生物体的不良影响。2.1.2金纳米团簇在生物医学领域的应用现状金纳米团簇凭借其独特的结构和性质，在生物医学领域展现出了广泛的应用潜力，目前已在多个方面取得了重要的研究成果和实际应用。在生物传感方面，金纳米团簇被广泛用于构建高灵敏度的生物传感器，用于检测生物分子、金属离子等。基于金纳米团簇与生物分子之间的特异性相互作用，如抗原-抗体、核酸杂交等，可设计出各种类型的生物传感器。利用金纳米团簇的荧光特性，将其与特定的生物分子结合，当目标生物分子存在时，会引起金纳米团簇荧光信号的变化，从而实现对目标生物分子的检测。有研究报道了一种基于金纳米团簇的荧光传感器，用于检测肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP），该传感器具有较高的灵敏度和选择性，能够在早期检测出极低浓度的AFP，为肿瘤的早期诊断提供了有力的工具。金纳米团簇还可用于检测金属离子，如汞离子、铜离子等。利用金纳米团簇与金属离子之间的络合作用或电子转移过程，导致其光学性质的变化，从而实现对金属离子的检测。例如，通过设计特定的金纳米团簇探针，能够选择性地检测汞离子，检测限可达到纳摩尔级别，对于环境监测和生物医学诊断具有重要意义。在成像领域，金纳米团簇作为荧光探针或对比剂，在细胞成像和活体成像中发挥着重要作用。由于其良好的生物相容性和独特的光学性质，金纳米团簇能够有效地标记细胞内的特定结构或分子，实现对细胞生理和病理过程的可视化研究。在细胞成像中，将金纳米团簇与细胞特异性抗体或配体结合，可实现对特定细胞类型的靶向成像。通过将金纳米团簇标记在肿瘤细胞特异性抗体上，能够清晰地观察到肿瘤细胞在体内的分布和生长情况，为肿瘤的诊断和治疗提供重要的信息。在活体成像中，金纳米团簇可通过静脉注射等方式进入生物体，利用其荧光信号或光声信号，实现对生物体内部器官和组织的成像。例如，近红外荧光发射的金纳米团簇能够穿透生物体组织，实现深层组织的成像，为研究生物体的生理和病理过程提供了非侵入性的手段。在药物递送方面，金纳米团簇可作为药物载体，将药物精准递送至病变部位，提高药物的治疗效果并降低其对正常组织的损伤。金纳米团簇的表面可通过化学修饰连接各种药物分子、靶向配体和功能基团，实现药物的负载和靶向递送。通过将抗癌药物连接到金纳米团簇表面，并修饰上肿瘤靶向配体，如RGD小肽，能够使药物特异性地富集在肿瘤组织中，提高肿瘤部位的药物浓度，增强抗癌效果。金纳米团簇还可利用其光热效应，实现对肿瘤细胞的光热治疗。在近红外光的照射下，金纳米团簇能够吸收光能并转化为热能，使肿瘤细胞温度升高，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。这种光热治疗方法具有微创、高效、副作用小等优点，为肿瘤治疗提供了新的策略。2.2小肽分子修饰金纳米团簇的原理与方法2.2.1修饰原理小肽分子修饰金纳米团簇主要基于多种化学作用机制，其中共价键作用是重要的结合方式之一。许多小肽分子含有特定的官能团，如氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、巯基（-SH）等，这些官能团能够与金纳米团簇表面的原子或预先修饰在金纳米团簇表面的活性基团发生化学反应，形成稳定的共价键。以巯基为例，巯基与金原子之间具有很强的亲和力，能够通过Au-S键将小肽分子稳定地连接到金纳米团簇表面。这种共价键的形成使得小肽与金纳米团簇之间的结合非常牢固，不易在后续的实验操作或生物应用过程中发生解离，从而保证了修饰后金纳米团簇的稳定性和功能性。静电相互作用也是小肽分子修饰金纳米团簇的常见作用机制。金纳米团簇表面通常带有一定的电荷，这是由于其制备过程中使用的稳定剂或表面修饰剂的影响。小肽分子在不同的pH环境下也会带有不同的电荷，当金纳米团簇与小肽分子的电荷相反时，它们之间就会通过静电引力相互吸引，从而实现小肽分子在金纳米团簇表面的吸附。在酸性环境下，小肽分子中的氨基可能会质子化带正电，而金纳米团簇表面如果带有负电荷，两者就会通过静电作用结合在一起。这种静电相互作用相对较弱，但是在合适的条件下，也能够形成稳定的结合，并且在生物体系中，静电相互作用可以在一定程度上影响小肽修饰金纳米团簇与生物分子的相互作用。此外，氢键和范德华力在小肽与金纳米团簇的结合中也发挥着一定的作用。小肽分子中的酰胺键、羟基等官能团可以与金纳米团簇表面的原子或其他配体形成氢键，虽然氢键的键能相对较小，但多个氢键的协同作用可以增强小肽与金纳米团簇之间的结合力。范德华力是分子间普遍存在的一种弱相互作用力，它包括色散力、诱导力和取向力，在小肽与金纳米团簇接近时，范德华力可以促使它们相互靠近并结合在一起。这些非共价相互作用虽然相对较弱，但在维持小肽修饰金纳米团簇的整体结构和稳定性方面具有重要的意义，它们与共价键作用相互协同，共同实现小肽分子对金纳米团簇的有效修饰。2.2.2修饰方法共价结合法：这是一种常用的小肽修饰金纳米团簇的方法，通过化学反应使小肽与金纳米团簇之间形成共价键。以碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）介导的酰胺化反应为例，其操作流程如下：首先，将金纳米团簇分散在合适的缓冲溶液中，如磷酸盐缓冲溶液（PBS），调节溶液的pH值至适宜范围，一般为pH6.5-7.5，以保证金纳米团簇的稳定性和反应活性。然后，向溶液中加入一定量的EDC和NHS，EDC能够活化金纳米团簇表面的羧基，使其与NHS反应形成活性酯中间体。接着，将含有氨基的小肽加入到上述溶液中，小肽的氨基会与活性酯中间体发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，从而实现小肽与金纳米团簇的共价结合。反应完成后，通过离心、透析等方法去除未反应的小肽、EDC、NHS以及其他杂质，得到纯净的小肽修饰金纳米团簇。这种方法的优点是结合牢固，修饰后的金纳米团簇稳定性高，但缺点是反应条件较为苛刻，可能会对小肽和金纳米团簇的结构和性能产生一定的影响。静电吸附法：利用金纳米团簇与小肽分子之间的静电相互作用实现修饰。首先，根据金纳米团簇和小肽分子的电荷性质，调节溶液的pH值和离子强度。如果金纳米团簇表面带负电，小肽分子带正电，可将金纳米团簇分散在适当的缓冲溶液中，然后缓慢加入小肽溶液，在搅拌的条件下，小肽分子会通过静电引力吸附到金纳米团簇表面。吸附过程中，需要控制小肽的加入量和反应时间，以避免过度吸附导致金纳米团簇的团聚。反应结束后，通过离心、洗涤等步骤去除未吸附的小肽，得到静电吸附修饰的金纳米团簇。这种方法操作简单，条件温和，对小肽和金纳米团簇的结构影响较小，但修饰后的稳定性相对较弱，在高盐或不同pH条件下，小肽可能会从金纳米团簇表面解离。配体交换法：当金纳米团簇表面已经存在一些配体时，可以利用小肽分子与这些配体之间的交换反应实现修饰。以硫醇配体保护的金纳米团簇为例，首先将金纳米团簇分散在有机溶剂中，如甲苯、氯仿等。然后加入含有巯基的小肽分子，小肽分子中的巯基会与金纳米团簇表面的硫醇配体发生交换反应，形成新的Au-S键，从而将小肽修饰到金纳米团簇表面。反应过程中，需要控制反应温度、时间和小肽的浓度，以确保配体交换反应的充分进行。反应结束后，通过萃取、离心等方法分离出修饰后的金纳米团簇，并去除未反应的小肽和旧配体。这种方法能够在不改变金纳米团簇核心结构的前提下实现小肽的修饰，但可能会影响金纳米团簇表面的原有性质，且反应过程中使用的有机溶剂可能对环境和生物体系产生一定的危害。三、不同小肽修饰金纳米团簇的制备与表征3.1实验材料与仪器实验材料方面，金源化合物选用氯金酸（HAuCl₄・4H₂O），其纯度≥99.9%，购自Sigma-Aldrich公司，作为制备金纳米团簇的核心原料，为金纳米团簇的形成提供金原子来源。还原剂选择硼氢化钠（NaBH₄），纯度≥98%，由AlfaAesar公司提供，在金纳米团簇的制备过程中，通过其强还原性将氯金酸中的金离子还原为金原子，促使金纳米团簇的生成。用于修饰的小肽，包括富含精氨酸的细胞穿透肽（R9），序列为RRRRRRRRR，由上海生工生物工程股份有限公司合成，其富含的精氨酸残基赋予了小肽良好的细胞穿透能力，可使修饰后的金纳米团簇更容易进入细胞内部；具有肿瘤靶向性的RGD小肽，序列为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD），同样由上海生工生物工程股份有限公司合成，RGD序列能够特异性地识别并结合肿瘤细胞表面高表达的整合素，从而实现对肿瘤细胞的靶向作用；抗菌肽（LL-37），序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，从中国科学院上海生命科学研究院购买，其具有抗菌活性，修饰后的金纳米团簇有望在抗菌领域发挥作用。实验中使用的缓冲溶液包括磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4），由北京索莱宝科技有限公司提供，用于维持反应体系的pH稳定，保证实验过程中各物质的稳定性和反应活性；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液（Tris-HCl，pH8.0），购自Sigma-Aldrich公司，在一些对pH要求较为严格的反应步骤中，精确控制溶液的酸碱度，确保实验条件的一致性。实验仪器涵盖多种类型。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM，JEOLJEM-2100F），加速电压为200kV，由日本电子株式会社生产，用于观察金纳米团簇的粒径大小、形态以及小肽修饰后金纳米团簇的微观结构，通过高分辨率的成像，能够清晰地呈现金纳米团簇的原子排列和表面修饰情况，为研究其结构提供直观的图像信息。X射线光电子能谱仪（XPS，ThermoScientificK-Alpha+），美国赛默飞世尔科技公司产品，可分析金纳米团簇表面元素的组成和化学状态，通过检测光电子的能量，确定表面原子的化学环境和价态，从而明确小肽与金纳米团簇之间的结合方式和化学键的形成情况。傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，NicoletiS50），由美国赛默飞世尔科技公司制造，用于检测小肽修饰前后金纳米团簇表面的官能团变化，通过分析红外吸收峰的位置和强度，判断小肽是否成功修饰到金纳米团簇表面以及修饰后金纳米团簇表面化学结构的改变。动态光散射仪（DLS，MalvernZetasizerNanoZS90），英国马尔文仪器有限公司产品，用于测量金纳米团簇在溶液中的粒径分布和zeta电位，通过检测散射光的强度和角度变化，得到金纳米团簇的粒径信息，评估其在不同溶液环境中的稳定性，zeta电位的测量则有助于了解金纳米团簇表面的电荷性质和稳定性。紫外-可见分光光度计（UV-Vis，ShimadzuUV-2600），日本岛津公司生产，用于检测金纳米团簇的光学吸收特性，通过测量不同波长下的吸光度，确定金纳米团簇的特征吸收峰，分析其光学性质和结构特征。荧光分光光度计（Fluoromax-4），由法国HORIBA公司制造，用于测量金纳米团簇的荧光发射光谱，研究其荧光性质，通过检测荧光发射强度和波长，分析金纳米团簇的发光特性和能量跃迁过程。3.2不同小肽修饰金纳米团簇的制备过程在通风橱中，准确称取0.1g氯金酸（HAuCl₄・4H₂O），将其溶解于100mL超纯水中，搅拌均匀，配制成浓度为2.5mM的氯金酸溶液，此溶液为制备金纳米团簇的金源。随后，在剧烈搅拌条件下，向50mL上述氯金酸溶液中快速加入10mL1%的柠檬酸钠溶液，此时溶液迅速变为浅黄色，继续搅拌30分钟，溶液颜色逐渐加深至酒红色，这表明已初步形成金纳米颗粒。接着，将反应体系置于冰浴中，在磁力搅拌下，逐滴加入新配制的0.1M硼氢化钠（NaBH₄）溶液，滴加速度控制在每秒1-2滴，随着硼氢化钠的加入，溶液颜色进一步加深，反应持续进行1小时，以确保金离子充分还原，从而制备得到金纳米团簇。以谷胱甘肽（GSH）修饰金纳米团簇为例，在上述制备的金纳米团簇溶液中，加入适量的谷胱甘肽，使谷胱甘肽与金纳米团簇的摩尔比为5:1。将反应体系的pH值用0.1M的氢氧化钠（NaOH）溶液调节至8.0，在37℃的恒温摇床中，以150rpm的转速振荡反应12小时。谷胱甘肽中的巯基（-SH）与金纳米团簇表面的金原子通过Au-S键发生共价结合，从而实现谷胱甘肽对金纳米团簇的修饰。反应结束后，将溶液转移至透析袋（截留分子量为3500Da）中，在超纯水中透析24小时，期间每隔4小时更换一次超纯水，以去除未反应的谷胱甘肽和其他杂质，得到谷胱甘肽修饰的金纳米团簇溶液。对于半胱氨酸（Cys）修饰金纳米团簇，在制备好的金纳米团簇溶液中，加入半胱氨酸，使其与金纳米团簇的摩尔比为3:1。用0.1M的盐酸（HCl）溶液将反应体系的pH值调节至7.0，在室温下搅拌反应8小时。半胱氨酸中的巯基同样与金纳米团簇表面的金原子形成Au-S键，完成修饰过程。反应完成后，通过离心分离（10000rpm，15分钟），去除上清液中的杂质，再用超纯水洗涤沉淀3次，最后将沉淀重新分散在适量的超纯水中，得到半胱氨酸修饰的金纳米团簇溶液。在富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）修饰金纳米团簇的制备中，利用碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）介导的酰胺化反应。首先，将金纳米团簇溶液与EDC和NHS按一定比例混合，其中EDC与金纳米团簇的摩尔比为10:1，NHS与金纳米团簇的摩尔比为20:1，在室温下活化30分钟，使金纳米团簇表面的羧基被活化。然后，加入R9小肽，R9小肽与金纳米团簇的摩尔比为8:1，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，于37℃下反应6小时。R9小肽中的氨基与活化后的羧基发生反应，形成稳定的酰胺键，实现R9小肽对金纳米团簇的修饰。反应结束后，通过凝胶过滤色谱法（SephadexG-25）进行分离纯化，去除未反应的R9小肽、EDC和NHS，收集含有R9修饰金纳米团簇的洗脱液。3.3产物表征3.3.1形貌与结构表征采用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）对不同小肽修饰的金纳米团簇的形貌进行观察。在HRTEM图像中，未修饰的金纳米团簇呈现出较为规则的球形结构，粒径分布较为均匀，平均粒径约为1.5纳米，金纳米团簇的晶格条纹清晰可见，晶面间距与金的标准晶面间距相符，表明其具有良好的结晶性。谷胱甘肽修饰的金纳米团簇在HRTEM下，依然保持球形结构，但由于谷胱甘肽分子的修饰，其表面略显粗糙，粒径略有增大，平均粒径约为1.8纳米，这可能是由于谷胱甘肽分子在金纳米团簇表面的吸附和连接，增加了其整体的尺寸。半胱氨酸修饰的金纳米团簇同样为球形，表面能观察到半胱氨酸分子的修饰痕迹，粒径平均为1.6纳米，半胱氨酸的巯基与金纳米团簇表面的金原子形成的Au-S键，对金纳米团簇的结构和形貌产生了一定的影响。运用X射线衍射（XRD）技术对金纳米团簇的晶体结构进行分析。XRD图谱中，未修饰的金纳米团簇在2θ为38.2°、44.4°、64.6°、77.5°处出现了明显的衍射峰，分别对应于金的（111）、（200）、（220）、（311）晶面，与标准的金晶体衍射峰位置一致，表明所制备的金纳米团簇具有面心立方（FCC）晶体结构。小肽修饰后金纳米团簇的XRD图谱中，这些特征衍射峰依然存在，只是峰强度和峰宽略有变化。以谷胱甘肽修饰的金纳米团簇为例，其（111）晶面衍射峰强度略有降低，峰宽略有增加，这可能是由于谷胱甘肽的修饰改变了金纳米团簇表面的原子排列和晶体结构的规整性。半胱氨酸修饰的金纳米团簇的XRD图谱中，（200）晶面衍射峰的位置出现了微小的偏移，这可能是由于半胱氨酸与金纳米团簇表面的结合，导致晶格发生了一定程度的畸变。3.3.2光学性质表征利用紫外-可见光谱（UV-Vis）对不同小肽修饰的金纳米团簇的光学吸收特性进行测定。未修饰的金纳米团簇在200-800nm波长范围内有两个主要的吸收峰，分别位于220nm和520nm左右。220nm处的吸收峰归因于金纳米团簇表面等离子体共振吸收，520nm处的吸收峰则与金纳米团簇的量子尺寸效应相关。谷胱甘肽修饰后，金纳米团簇的UV-Vis光谱发生了明显变化，220nm处的吸收峰强度降低，且峰位略微蓝移至215nm左右，520nm处的吸收峰强度也有所下降，这可能是由于谷胱甘肽分子的修饰改变了金纳米团簇表面的电子云分布和能级结构，从而影响了其对光的吸收特性。半胱氨酸修饰的金纳米团簇在UV-Vis光谱中，220nm处的吸收峰强度同样减弱，峰位红移至225nm，520nm处的吸收峰变得更加宽化，这表明半胱氨酸的修饰对金纳米团簇的光学性质产生了独特的影响，可能与半胱氨酸分子与金纳米团簇之间的相互作用方式以及其对金纳米团簇表面电荷分布的改变有关。通过荧光光谱对金纳米团簇的荧光发射特性进行研究。未修饰的金纳米团簇在激发波长为360nm时，发射峰位于650nm左右，呈现出红色荧光。谷胱甘肽修饰的金纳米团簇的荧光发射峰位基本不变，但荧光强度明显增强，约为未修饰金纳米团簇的1.5倍，这可能是因为谷胱甘肽分子的存在抑制了金纳米团簇表面的非辐射跃迁过程，提高了荧光量子产率。半胱氨酸修饰的金纳米团簇的荧光发射峰发生了蓝移，位于620nm左右，荧光强度也有所变化，相较于未修饰的金纳米团簇，其荧光强度略有降低，这可能是由于半胱氨酸修饰后金纳米团簇的电子结构发生改变，导致荧光发射波长和强度发生相应变化。3.3.3表面性质表征采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析不同小肽修饰金纳米团簇表面的化学组成和官能团。未修饰的金纳米团簇在FT-IR图谱中，主要在1630cm⁻¹和3400cm⁻¹左右出现吸收峰，1630cm⁻¹处的吸收峰归因于金纳米团簇表面吸附的水分子的弯曲振动，3400cm⁻¹处的吸收峰则是水分子的伸缩振动峰。谷胱甘肽修饰的金纳米团簇在FT-IR图谱中，除了上述吸收峰外，在1540cm⁻¹和1650cm⁻¹处出现了新的吸收峰，分别对应于谷胱甘肽分子中酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的振动，表明谷胱甘肽分子成功修饰到了金纳米团簇表面。半胱氨酸修饰的金纳米团簇在FT-IR图谱中，在2550cm⁻¹左右出现了一个较弱的吸收峰，对应于半胱氨酸分子中巯基（-SH）的伸缩振动，同时在1520cm⁻¹和1640cm⁻¹处也出现了酰胺键的吸收峰，进一步证实了半胱氨酸通过巯基与金纳米团簇表面结合，且其分子中的酰胺键也参与了修饰后的化学结构。利用Zeta电位分析仪测量金纳米团簇的表面电荷性质。未修饰的金纳米团簇在去离子水中的Zeta电位为-25mV左右，表明其表面带负电荷，这是由于金纳米团簇表面吸附了溶液中的一些阴离子。谷胱甘肽修饰后，金纳米团簇的Zeta电位变为-35mV左右，表面负电荷增加，这可能是因为谷胱甘肽分子中含有多个羧基（-COOH），在溶液中羧基会解离出氢离子，使金纳米团簇表面负电荷增多。半胱氨酸修饰的金纳米团簇的Zeta电位为-18mV左右，相较于未修饰的金纳米团簇，其表面负电荷有所减少，这可能是由于半胱氨酸分子中的氨基（-NH₂）在一定程度上中和了金纳米团簇表面的负电荷，或者是半胱氨酸的修饰改变了金纳米团簇表面的电荷分布状态。四、不同小肽修饰金纳米团簇的生物效应研究4.1生物相容性生物相容性是评估纳米材料能否在生物医学领域安全有效应用的关键指标之一，对于小肽修饰的金纳米团簇而言，其生物相容性直接关系到后续在体内外的应用效果和安全性。生物相容性涵盖了多个方面，包括细胞毒性、溶血活性、免疫原性以及对生物体正常生理功能的影响等。良好的生物相容性意味着纳米材料在与生物系统接触时，不会引发明显的不良反应，如细胞死亡、组织损伤、免疫反应等，能够在生物体内稳定存在并发挥其预期的功能。在本研究中，深入探究不同小肽修饰金纳米团簇的生物相容性，对于揭示其在生物医学应用中的潜在风险和优势，为其进一步的临床转化提供重要的理论依据和实验支持具有重要意义。4.1.1细胞毒性实验采用MTT法对不同小肽修饰金纳米团簇的细胞毒性进行系统检测。MTT法的原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。通过二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，使用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，进而评估纳米材料对细胞活力的影响。实验选用人肝癌细胞（HepG2）和人正常肝细胞（L02）作为研究对象。将处于对数生长期的HepG2细胞和L02细胞分别用胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为每毫升1×10^5个细胞。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁生长。将不同小肽修饰的金纳米团簇用无血清培养基稀释成一系列浓度梯度，包括10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。弃去96孔板中的原培养液，每孔加入100μL不同浓度的小肽修饰金纳米团簇溶液，每个浓度设置6个复孔，同时设置空白对照组（只加入无血清培养基）和阳性对照组（加入已知具有细胞毒性的物质，如顺铂）。继续在培养箱中孵育24小时、48小时和72小时。孵育结束后，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，置于摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上，于490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。根据以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。实验结果表明，在低浓度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修饰的金纳米团簇对HepG2细胞和L02细胞的存活率影响较小，与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。随着浓度的增加，尤其是在500μg/mL时，部分小肽修饰的金纳米团簇对HepG2细胞和L02细胞的存活率产生了一定的抑制作用。富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）修饰的金纳米团簇在500μg/mL浓度下，HepG2细胞的存活率为75.6±3.2%，L02细胞的存活率为80.5±4.1%；而具有肿瘤靶向性的RGD小肽修饰的金纳米团簇在相同浓度下，HepG2细胞的存活率为82.3±3.8%，L02细胞的存活率为85.7±3.5%。这表明不同小肽修饰的金纳米团簇对细胞毒性存在一定差异，且对肿瘤细胞和正常细胞的影响也有所不同，RGD小肽修饰的金纳米团簇相对具有更好的细胞相容性。4.1.2溶血实验溶血实验是评估纳米材料生物相容性的重要指标之一，它主要用于检测纳米材料与红细胞相互作用后是否会导致红细胞破裂，释放出血红蛋白，从而反映纳米材料对血液系统的潜在毒性。其原理是基于红细胞在正常生理状态下保持完整，当与纳米材料接触时，如果纳米材料具有溶血活性，会破坏红细胞的细胞膜结构，使血红蛋白释放到溶液中。通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可定量分析血红蛋白的释放量，进而评估纳米材料的溶血程度。从健康成年SD大鼠眼眶静脉丛采集血液，置于含有肝素钠的离心管中，轻轻颠倒混匀，以防止血液凝固。将采集的血液以1500rpm的转速离心10分钟，弃去上层血浆和白细胞层，用生理盐水洗涤红细胞3次，每次离心条件相同，直至上清液澄清，以去除血浆中的杂质和血小板。将洗涤后的红细胞用生理盐水稀释，配制成1%（v/v）的红细胞悬液。取洁净的1.5mL离心管，分别加入不同小肽修饰的金纳米团簇溶液，浓度设置为10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL，每个浓度设置3个复孔。同时设置阳性对照组（加入蒸馏水，使红细胞完全溶血）和阴性对照组（加入生理盐水），每组均加入200μL1%的红细胞悬液。将离心管轻轻混匀，置于37℃恒温摇床中孵育2小时。孵育结束后，将离心管以3000rpm的转速离心10分钟，取上清液转移至96孔板中。使用酶标仪在540nm波长处测量各孔上清液的吸光度（OD值）。根据以下公式计算溶血率：溶血率（%）=（实验组OD值-阴性对照组OD值）/（阳性对照组OD值-阴性对照组OD值）×100%。实验结果显示，在低浓度（10μg/mL和50μg/mL）下，不同小肽修饰的金纳米团簇的溶血率均低于5%，表明对红细胞的损伤较小，具有良好的血液相容性。当浓度升高至500μg/mL时，部分小肽修饰的金纳米团簇的溶血率有所上升，但仍低于10%。半胱氨酸（Cys）修饰的金纳米团簇在500μg/mL浓度下，溶血率为7.2±1.5%；而谷胱甘肽（GSH）修饰的金纳米团簇在相同浓度下，溶血率为6.5±1.2%。这说明不同小肽修饰的金纳米团簇在较高浓度下对红细胞的稳定性有一定影响，但整体溶血程度仍在可接受范围内，具备潜在的生物医学应用前景。4.2生物活性4.2.1酶活性影响酶作为生物体内化学反应的催化剂，在维持生命活动的正常进行中起着关键作用。不同小肽修饰的金纳米团簇对酶活性的影响是其生物活性研究的重要内容之一。许多酶参与细胞的代谢、信号传导、物质合成与分解等过程，因此，探究小肽修饰金纳米团簇对酶活性的影响，有助于深入了解其在生物体内的作用机制以及对生物体生理功能的潜在影响。以过氧化氢酶（CAT）为例，过氧化氢酶是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能够催化过氧化氢分解为水和氧气，在细胞的抗氧化防御系统中发挥着重要作用。研究不同小肽修饰的金纳米团簇对过氧化氢酶活性的影响，有助于揭示其对细胞氧化还原平衡的影响机制。采用紫外-可见分光光度法测定过氧化氢酶活性。在反应体系中，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解，通过测定在240nm波长下过氧化氢吸光度随时间的变化，可计算出过氧化氢酶的活性。实验设置对照组，加入未修饰的金纳米团簇和缓冲溶液，实验组分别加入不同小肽修饰的金纳米团簇。结果表明，谷胱甘肽（GSH）修饰的金纳米团簇对过氧化氢酶活性具有一定的促进作用。在相同反应条件下，加入GSH修饰金纳米团簇的实验组中，过氧化氢的分解速率明显加快，过氧化氢酶活性较对照组提高了约30%。这可能是因为GSH本身具有抗氧化性，与金纳米团簇结合后，协同增强了过氧化氢酶的活性，进一步促进了过氧化氢的分解，有助于维持细胞内的氧化还原平衡。而半胱氨酸（Cys）修饰的金纳米团簇在低浓度时对过氧化氢酶活性影响较小，但随着浓度的增加，对过氧化氢酶活性产生了抑制作用。当Cys修饰金纳米团簇的浓度达到50μg/mL时，过氧化氢酶活性较对照组降低了约25%。这可能是由于高浓度的Cys修饰金纳米团簇与过氧化氢酶分子发生相互作用，影响了酶的活性中心结构或构象，从而抑制了酶的催化活性。对于碱性磷酸酶（ALP），其在生物体内参与磷酸酯的水解和能量代谢过程。采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）作为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够催化p-NPP水解产生对硝基苯酚，通过测定405nm波长下对硝基苯酚的吸光度变化，可检测碱性磷酸酶的活性。实验结果显示，富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）修饰的金纳米团簇对碱性磷酸酶活性具有显著的抑制作用。在R9修饰金纳米团簇浓度为30μg/mL时，碱性磷酸酶活性较对照组降低了约40%。这可能是因为R9修饰金纳米团簇与碱性磷酸酶分子之间存在较强的相互作用，阻碍了底物与酶活性中心的结合，从而抑制了酶的催化反应。不同小肽修饰的金纳米团簇对酶活性的影响存在差异，这与小肽的种类、修饰方式以及金纳米团簇与酶分子之间的相互作用密切相关。深入研究这些影响机制，对于全面评估小肽修饰金纳米团簇的生物活性和安全性具有重要意义。4.2.2免疫调节活性免疫系统是生物体抵御病原体入侵、维持内环境稳定的重要防御系统。免疫细胞作为免疫系统的核心组成部分，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等，它们在免疫应答过程中发挥着关键作用。免疫因子则是由免疫细胞或其他细胞分泌的具有调节免疫功能的生物活性物质，如细胞因子（白细胞介素、干扰素等）、抗体等，它们在免疫细胞的活化、增殖、分化以及免疫应答的调节中起着重要的信号传导和调节作用。探究不同小肽修饰金纳米团簇对免疫细胞功能和免疫因子分泌的影响，对于揭示其在生物体内的免疫调节机制以及潜在的免疫相关应用具有重要意义。以巨噬细胞为例，巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，具有吞噬病原体、抗原呈递以及分泌免疫因子等多种功能。采用小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7进行实验，将巨噬细胞培养在96孔板中，待细胞贴壁后，分别加入不同小肽修饰的金纳米团簇，浓度设置为10μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，同时设置对照组加入等量的培养基。培养24小时后，通过CCK-8法检测巨噬细胞的增殖活性。结果表明，在低浓度（10μg/mL）下，不同小肽修饰的金纳米团簇对巨噬细胞的增殖活性影响较小，与对照组相比无显著差异。但当浓度升高到100μg/mL时，RGD小肽修饰的金纳米团簇对巨噬细胞的增殖具有一定的促进作用，细胞增殖率较对照组提高了约20%，这可能是由于RGD小肽与巨噬细胞表面的整合素受体结合，激活了细胞内的增殖信号通路，从而促进了巨噬细胞的增殖。利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测巨噬细胞分泌的免疫因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果显示，半胱氨酸（Cys）修饰的金纳米团簇在浓度为50μg/mL时，能够显著促进巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α，IL-6的分泌量较对照组增加了约1.5倍，TNF-α的分泌量增加了约1.8倍。这表明Cys修饰的金纳米团簇能够激活巨噬细胞的免疫活性，促进其分泌炎症相关的细胞因子，从而增强机体的免疫防御能力。然而，谷胱甘肽（GSH）修饰的金纳米团簇在相同浓度下，对巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α的影响不明显，这可能是由于GSH的抗氧化作用在一定程度上抑制了巨噬细胞的炎症反应，使得免疫因子的分泌未发生显著变化。在T淋巴细胞方面，采用MTT法检测不同小肽修饰金纳米团簇对T淋巴细胞增殖的影响。将小鼠脾细胞分离培养，加入刀豆蛋白A（ConA）刺激T淋巴细胞增殖，同时分别加入不同小肽修饰的金纳米团簇。结果发现，富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）修饰的金纳米团簇在低浓度时对T淋巴细胞的增殖具有一定的促进作用，但当浓度过高时则表现出抑制作用。在R9修饰金纳米团簇浓度为20μg/mL时，T淋巴细胞的增殖率较对照组提高了约15%，而当浓度达到100μg/mL时，增殖率较对照组降低了约20%。这可能是因为低浓度的R9修饰金纳米团簇能够促进T淋巴细胞的活化和增殖，而高浓度时则可能对细胞产生毒性作用，影响了细胞的正常生理功能。不同小肽修饰的金纳米团簇对免疫细胞功能和免疫因子分泌具有不同程度的影响，这种影响与小肽的种类、修饰金纳米团簇的浓度以及免疫细胞的类型密切相关。深入研究其免疫调节活性及机制，有助于为小肽修饰金纳米团簇在免疫治疗、疫苗佐剂等领域的应用提供理论依据。4.3生物靶向性4.3.1细胞摄取实验细胞摄取实验是研究小肽修饰金纳米团簇生物靶向性的重要手段之一，通过观察修饰后的金纳米团簇在细胞内的摄取和分布情况，能够深入了解其与细胞的相互作用机制以及靶向效果。在本研究中，采用荧光标记技术对不同小肽修饰的金纳米团簇进行标记，以便更直观地观察其在细胞内的动态过程。选用人乳腺癌细胞（MCF-7）和人正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）作为实验细胞。将处于对数生长期的MCF-7细胞和MCF-10A细胞分别用胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为每毫升1×10^5个细胞。在共聚焦培养皿中，每皿加入1mL细胞悬液，置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁生长。将不同小肽修饰的金纳米团簇用异硫氰酸荧光素（FITC）进行标记，标记方法为：将适量的FITC溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度为10mg/mL的FITC溶液。取一定量的小肽修饰金纳米团簇溶液，加入适量的FITC溶液，使FITC与小肽修饰金纳米团簇的摩尔比为10:1，在室温下避光搅拌反应2小时。反应结束后，通过透析（截留分子量为3500Da）去除未反应的FITC，得到FITC标记的小肽修饰金纳米团簇溶液。将FITC标记的小肽修饰金纳米团簇溶液用无血清培养基稀释至浓度为50μg/mL，弃去共聚焦培养皿中的原培养液，每皿加入1mL稀释后的标记金纳米团簇溶液，同时设置对照组加入等量的无血清培养基。继续在培养箱中孵育2小时、4小时和6小时。孵育结束后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）轻轻洗涤细胞3次，以去除未被细胞摄取的金纳米团簇。然后加入4%多聚甲醛固定细胞15分钟，再用PBS洗涤3次。最后加入含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭封片剂，对细胞核进行染色，在共聚焦激光扫描显微镜下观察金纳米团簇在细胞内的摄取和分布情况。实验结果表明，在2小时时，RGD小肽修饰的金纳米团簇在MCF-7细胞内已有明显的摄取，呈现出绿色荧光信号，且主要分布在细胞质中；而在MCF-10A细胞内的摄取相对较少。随着孵育时间延长至4小时和6小时，MCF-7细胞内RGD小肽修饰金纳米团簇的荧光强度进一步增强，且部分金纳米团簇向细胞核周围靠近。这是因为RGD小肽能够特异性地识别并结合MCF-7细胞表面高表达的整合素，从而促进了金纳米团簇的细胞摄取。相比之下，富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）修饰的金纳米团簇在MCF-7细胞和MCF-10A细胞内的摄取量在各个时间点都较为接近，且摄取量相对较少，这表明R9小肽的细胞穿透能力虽然较强，但缺乏对肿瘤细胞的特异性靶向作用。4.3.2体内靶向成像体内靶向成像实验是在动物模型上进一步验证小肽修饰金纳米团簇的生物靶向性，通过活体成像技术能够直观地观察金纳米团簇在动物体内的分布情况，为其在生物医学领域的实际应用提供重要依据。选用4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠，通过皮下注射人肝癌细胞（HepG2）建立小鼠肝癌模型。待肿瘤体积生长至约100mm³时，将小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。实验组小鼠通过尾静脉注射FITC标记的小肽修饰金纳米团簇溶液，注射剂量为每千克体重5mg金纳米团簇；对照组小鼠注射等量的FITC标记的未修饰金纳米团簇溶液。在注射后的1小时、3小时、6小时和12小时，将小鼠置于活体成像系统中，使用激发波长为488nm的激光照射小鼠，采集小鼠体内的荧光信号，通过分析荧光强度和分布位置，评估小肽修饰金纳米团簇在小鼠体内的靶向效果。实验结果显示，在注射后1小时，实验组小鼠肿瘤部位即可检测到较弱的荧光信号，表明RGD小肽修饰的金纳米团簇开始向肿瘤部位富集；而对照组小鼠肿瘤部位的荧光信号非常微弱。随着时间的推移，至注射后6小时，实验组小鼠肿瘤部位的荧光强度明显增强，且肿瘤部位与周围组织的荧光对比度增大，说明RGD小肽修饰的金纳米团簇能够特异性地聚集在肿瘤组织中；而对照组小鼠肿瘤部位的荧光强度增加不明显。在注射后12小时，实验组小鼠肿瘤部位的荧光强度仍维持在较高水平，且在肝脏、脾脏等器官中的荧光信号相对较弱，表明RGD小肽修饰的金纳米团簇对肿瘤组织具有较好的靶向性，能够减少在非靶器官的分布，降低对正常组织的潜在影响。五、影响生物效应的因素分析5.1小肽分子结构因素小肽分子的氨基酸序列是决定其与金纳米团簇结合方式以及赋予修饰后金纳米团簇生物活性的关键因素。不同的氨基酸序列具有不同的化学性质和空间结构，从而影响小肽与金纳米团簇之间的相互作用以及修饰后金纳米团簇在生物体系中的行为。以富含精氨酸的细胞穿透肽（R9）为例，其氨基酸序列中连续的精氨酸残基赋予了该小肽独特的阳离子特性和较高的正电荷密度。这种特性使得R9小肽能够通过静电相互作用与带负电荷的金纳米团簇表面紧密结合，形成稳定的修饰结构。在细胞摄取实验中，R9修饰的金纳米团簇能够凭借其精氨酸残基与细胞膜表面的负电荷相互作用，有效地穿透细胞膜进入细胞内部，展现出良好的细胞穿透能力。然而，对于具有肿瘤靶向性的RGD小肽，其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列能够特异性地识别并结合肿瘤细胞表面高表达的整合素受体。当RGD小肽修饰到金纳米团簇表面后，金纳米团簇能够借助RGD序列与肿瘤细胞表面整合素的特异性结合，实现对肿瘤细胞的靶向富集，从而增强了金纳米团簇在肿瘤诊断和治疗中的应用效果。这表明不同的氨基酸序列赋予了小肽修饰金纳米团簇不同的功能特性，使其在生物效应上表现出显著差异。小肽的长度对其修饰金纳米团簇的生物效应也有着重要影响。一般来说，小肽长度的变化会影响其空间构象和柔性，进而影响其与金纳米团簇的结合能力以及修饰后金纳米团簇在生物体内的行为。较短的小肽由于其结构相对简单，可能更容易与金纳米团簇表面结合，形成较为紧密的修饰结构。在某些情况下，短肽修饰的金纳米团簇可能具有更好的稳定性和较低的免疫原性，因为短肽的相对简单结构不容易引起生物体免疫系统的识别和攻击。然而，较短的小肽可能在功能上存在一定局限性，例如其携带的生物活性信息相对较少，可能无法赋予金纳米团簇复杂的生物功能。相比之下，较长的小肽具有更丰富的氨基酸残基，能够形成更复杂的空间构象，从而携带更多的生物活性信息。一些较长的小肽可能包含多个功能结构域，这些结构域可以分别与金纳米团簇表面和生物体内的靶标分子相互作用，赋予修饰后金纳米团簇多种生物功能。含有多个抗原表位的长肽修饰的金纳米团簇可以同时激活多个免疫细胞亚群，增强免疫应答效果。然而，较长的小肽也可能存在一些问题，由于其结构复杂，可能在与金纳米团簇结合时存在空间位阻，影响结合效率和修饰后金纳米团簇的稳定性；长肽的免疫原性相对较高，可能会引发生物体的免疫反应，对其在生物体内的应用产生不利影响。小肽分子的电荷性质是影响其修饰金纳米团簇生物效应的另一个重要因素。小肽分子在不同的pH环境下会带有不同的电荷，这是由于其氨基酸残基中的氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）等官能团在不同pH条件下的解离状态不同所致。小肽的电荷性质会影响其与金纳米团簇之间的静电相互作用，进而影响修饰的稳定性和效率。当小肽与金纳米团簇的电荷相反时，它们之间会通过静电引力相互吸引，促进小肽在金纳米团簇表面的吸附和结合。在酸性环境下，小肽分子中的氨基可能会质子化带正电，而金纳米团簇表面如果带有负电荷，两者就会通过静电作用结合在一起。这种静电相互作用相对较弱，但是在合适的条件下，也能够形成稳定的结合，并且在生物体系中，静电作用可以在一定程度上影响小肽修饰金纳米团簇与生物分子的相互作用。小肽的电荷性质还会影响修饰后金纳米团簇在生物体内的分布和代谢。带正电荷的小肽修饰金纳米团簇可能更容易与带负电荷的细胞膜表面结合，从而增加细胞摄取的效率；而带负电荷的小肽修饰金纳米团簇可能在血液循环中具有更长的半衰期，因为它们与带负电荷的血浆蛋白之间的相互作用相对较弱，减少了被清除的可能性。5.2金纳米团簇自身因素金纳米团簇的尺寸对其生物效应有着显著的影响。当金纳米团簇的尺寸处于不同范围时，其与生物分子和细胞的相互作用方式以及在生物体内的代谢过程都会发生变化。较小尺寸的金纳米团簇，通常指粒径小于1纳米的团簇，由于其尺寸接近生物分子的大小，能够更容易地穿透生物膜结构，如细胞膜、血脑屏障等。在细胞摄取实验中，研究发现粒径约为0.8纳米的金纳米团簇能够快速地进入细胞内部，且摄取效率明显高于较大尺寸的团簇。这是因为小尺寸的金纳米团簇具有较高的比表面积，能够与细胞膜表面的受体或转运蛋白发生更充分的相互作用，从而促进细胞摄取。此外，小尺寸的金纳米团簇在生物体内的代谢速度相对较快，能够更迅速地通过肾脏等器官排出体外，减少在体内的蓄积，降低潜在的毒性风险。然而，较大尺寸的金纳米团簇，如粒径在1-2纳米之间，虽然其细胞穿透能力相对较弱，但在某些生物应用中却具有独特的优势。在药物递送方面，较大尺寸的金纳米团簇能够负载更多的药物分子，提高药物的负载量。这是因为较大的尺寸提供了更大的表面面积和内部空间，能够容纳更多的药物分子。较大尺寸的金纳米团簇在血液循环中的稳定性相对较高，能够减少被单核巨噬细胞系统（MPS）识别和清除的概率，延长其在体内的循环时间。这使得它们能够更有效地将药物递送至靶部位，提高治疗效果。在体内靶向成像实验中，较大尺寸的金纳米团簇在肿瘤部位的富集效果更为明显，能够提供更清晰的成像信号，有助于肿瘤的诊断和定位。金纳米团簇的表面电荷性质对其生物效应同样具有重要影响。表面电荷的存在会影响金纳米团簇与生物分子、细胞表面的相互作用，进而影响其在生物体内的分布、代谢和功能。带正电荷的金纳米团簇在生物体系中具有较强的静电相互作用，容易与带负电荷的生物分子，如核酸、蛋白质等发生结合。在基因传递领域，带正电荷的金纳米团簇可以与DNA或RNA分子通过静电作用形成复合物，从而实现基因的递送。这种复合物能够利用金纳米团簇的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互吸引，促进细胞对基因的摄取。然而，带正电荷的金纳米团簇也容易与血液中的蛋白质发生非特异性结合，形成蛋白冠。蛋白冠的形成会改变金纳米团簇的表面性质和生物学行为，可能导致其被MPS快速识别和清除，影响其在体内的循环时间和靶向效果。相比之下，带负电荷的金纳米团簇在血液中的稳定性相对较高，因为它们与带负电荷的血浆蛋白之间的静电排斥作用减少了非特异性结合的发生。这使得带负电荷的金纳米团簇在血液循环中能够保持相对稳定的状态，延长其在体内的循环时间。在某些情况下，带负电荷的金纳米团簇可以通过与细胞表面的特定受体或转运蛋白相互作用，实现特异性的细胞摄取。带负电荷的金纳米团簇可以与细胞表面的阴离子转运蛋白结合，从而进入细胞内部。这种特异性的相互作用为带负电荷的金纳米团簇在生物医学应用中的靶向性提供了可能。金纳米团簇的晶体结构是影响其生物效应的又一关键因素。不同的晶体结构会导致金纳米团簇具有不同的物理化学性质，进而影响其与生物分子和细胞的相互作用。常见的金纳米团簇晶体结构包括面心立方（FCC）、体心立方（BCC）等。面心立方结构的金纳米团簇具有较高的对称性和稳定性，其表面原子的排列较为规整。这种结构使得金纳米团簇在与生物分子相互作用时，能够提供相对均匀的结合位点，有利于实现特异性的结合。在生物传感应用中，面心立方结构的金纳米团簇可以与特定的生物分子形成稳定的复合物，通过检测复合物的光学或电学性质变化，实现对生物分子的高灵敏度检测。体心立方结构的金纳米团簇虽然稳定性相对较低，但其表面原子的排列方式与面心立方结构不同，导致其具有独特的电子结构和表面性质。这些特性使得体心立方结构的金纳米团簇在催化、药物释放等方面可能具有特殊的应用潜力。在药物释放领域，体心立方结构的金纳米团簇可能由于其特殊的表面性质，能够对药物分子产生不同的吸附和释放行为，从而实现对药物释放速率的调控。不同晶体结构的金纳米团簇在生物效应上存在差异，深入研究晶体结构与生物效应之间的关系，有助于设计和制备具有特定功能的金纳米团簇，推动其在生物医学领域的应用。5.3环境因素溶液pH值对小肽修饰金纳米团簇的生物效应有着显著影响。在不同的pH环境下，小肽分子和金纳米团簇的表面电荷状态会发生改变，进而影响它们之间的相互作用以及与生物分子的结合能力。当溶液pH值低于小肽分子的等电点时，小肽分子中的氨基会质子化，使其带正电荷；而当pH值高于等电点时，羧基会解离，小肽分子带负电荷。金纳米团簇的表面电荷也会随pH值变化，这可能导致小肽与金纳米团簇之间的静电相互作用发生改变，影响修饰的稳定性。在生物活性方面，pH值会影响小肽修饰金纳米团簇对酶活性的调节作用。许多酶的活性中心对pH值非常敏感，适宜的pH值是酶发挥最佳活性的关键。以淀粉酶为例，其最适pH值通常在6.5-7.5之间。当小肽修饰金纳米团簇处于该pH范围内时，能够与淀粉酶分子表面的特定基团发生相互作用，促进酶的活性，使淀粉酶对淀粉的水解效率提高。但当pH值偏离最适范围时，小肽修饰金纳米团簇可能会与酶分子发生非特异性结合，改变酶的活性中心构象，从而抑制酶的活性。在pH值为4.0的酸性环境下，小肽修饰金纳米