食品微生物 食品微生物检验技术5-3学习资料

第七节厌氧菌概念:

是一大群必须在无氧环境条件下才能生长繁殖的细菌特点:

种类多分布广感染可发生于人体各个部位

厌氧菌特点特点芽胞厌氧菌无芽孢厌氧菌种类1个菌属40多属分布自然界人和动物体内致病外源性感染多以外毒素致病内源性感染多为条件致病菌根据能否形成芽胞,可分为厌氧菌感染的临床及细菌学特征感染发生于黏膜附近深部外伤感染局部有气体产生分泌物有恶臭或暗血红色某些抗生素治疗无效的感染标本直接涂片细菌染色不均镜检见细菌,需氧培养无细菌培养厌氧菌感染的原因局部形成厌氧微环境局部或全身免疫功能下降菌群失调寄居部位发生改变厌氧菌－－标本采集与送检

采集部位恰当正确采集避免污染严格厌氧及时送检

运送针筒运送法无氧小瓶运送法标本充盈运送法组织块运送法厌氧袋运送法棉拭运送法厌氧菌－－常用培养基非选择性培养基心脑浸液＋％5脱纤维羊血＋氯化血红素＋维生素K选择培养基七叶苷胆汁平板－－培养脆弱类杆菌卡那万古冻溶血琼脂平板－－培养

FS培养基－－培养梭杆菌属

VS培养基－－培养韦容球菌

CCFA培养基－－培养艰难梭菌厌氧菌－－厌氧培养法厌氧罐培养法厌氧器袋法厌氧手套箱法疱肉培养法标本

增菌分离培养挑取菌落肉眼观察染色镜检血标本需氧培养厌氧培养厌氧培养厌氧培养生长不生长生长专性厌氧菌兼性厌氧菌形态染色菌落特征生化反应药敏鉴定气相色谱厌氧菌－－标本观察和涂片镜检肉眼观察：观察标本的性状（脓性、带血、气味、硫磺样颗粒、坏死组织等）涂片染色镜检：估计细菌数量、观察细菌形态、染色性，以便选择培养基和培养方法厌氧菌－－分离培养初代培养：厌氧培养48h次代培养：挑5个以上不同菌落做耐氧试验，每个菌落接种2个平板，分别进行需氧培养和厌氧培养，挑取有氧培养中不生长、厌氧培养生长的菌落进行鉴定厌氧菌－－鉴定菌体形态：菌落性状：形状、色素、荧光、溶血药敏鉴定试验：卡那霉素：梭杆菌属多敏感，类杆菌属多耐药聚茴香脑磺酸钠：快速鉴定厌氧消化链球菌生化反应气相色谱技术破伤风芽孢梭菌－－主要性状革兰阳性细长杆菌，有周鞭毛，芽孢位于菌体顶端，圆形大于菌体，呈“火柴棒状”，无荚膜专性厌氧在血平板上呈扩散生长，菌落边缘不整齐，呈羽毛状有β溶血在疱肉培养基中，肉渣变黑，有腐败恶臭味芽孢对外界抵抗力强,能耐煮沸1h,在干燥的土壤和尘埃中可存活数十年。破伤风芽孢梭菌－－临床意义致病物质：1.破伤风痉挛毒素阻止中枢抑制性神经介质的释放，导致骨骼肌（屈肌）强制性痉挛

1）为神经毒素,由质粒编码。

2）为蛋白质,不耐热,也可被肠道中的蛋白酶分解。

3）经甲醛脱毒成为类毒素,接种后可产生抗毒素。

4）毒性极强,仅次于肉毒毒素。2.破伤风溶血毒素(tetanolysin)所致疾病：破伤风感染途径：伤口致病条件：伤口内形成厌氧微环境

早期症状有流口水、出汗和激动;

典型体征是苦笑面容、牙关紧闭、角弓反张等。

因植物性神经系统功能紊乱,还可产生心率不齐

、血压波动和因大量出汗造成的脱水。破伤风梭菌在创伤局部繁殖过程中产生痉挛毒素,经局部神经细胞吸收或经淋巴、血液到达中枢神经系统而致病。破伤风梭菌破伤风芽孢梭菌－－检查方法显微镜检查：菌体形态、芽孢特征分离培养：厌氧培养，菌落特征动物实验：毒力试验：毒素注射小鼠→小鼠出现症状保护试验：

毒素＋抗毒素→注射小鼠→小鼠无症状产气荚膜梭菌－－形态与培养革兰阳性粗大杆菌，有荚膜，芽孢位于菌体中央或次级端，小于菌体，无鞭毛专性厌氧血平板菌落特征：圆形、凸起、光滑、湿润，双层溶血环卵黄琼脂平板：卵磷脂酶阳性

(Nagler反应)牛乳培养基：“汹涌发酵”现象生化反应：生化反应活泼，分解多种糖产气荚膜梭菌－－临床意义致病物质：荚膜、多种毒素和侵袭性酶所致疾病：

气性坏疽食物中毒坏死性肠炎产气荚膜梭菌－－检查方法标本涂片染色镜检：观察形态、染色性、荚膜分离培养：注意观察双圈溶血环生化反应：汹涌发酵现象动物实验：培养物→小鼠腹腔注射→处死小鼠→培养→解剖小鼠→肉眼观察泡沫肝＋涂片染色镜检肉毒梭菌－－形态与培养革兰阳性粗大杆菌，有鞭毛，芽孢位于菌体次级端，大于菌体，呈“网球拍状”无荚膜专性厌氧菌落大而不规则；消化肉渣，肉渣变黑，有腐败恶臭肉毒梭菌－－临床意义致病物质：肉毒毒素，为神经毒素，引起肌肉驰缓型麻痹。毒素分为8个型别，我国以A型最多见所致疾病肉毒食物中毒婴儿肉毒病肉毒梭菌－－检验程序标本

分离培养可疑菌落毒素测定疱肉培养革兰染色生化反应毒素测定肉毒梭菌－－检验方法标本采集：可疑食物、呕吐物等分离培养：疱肉培养、分离培养毒素测定毒素定性检验：

毒素注射小鼠→小鼠出现症状毒素＋抗毒素→注射小鼠→小鼠无症状毒素型别鉴定：鉴定依据：形态、芽孢特征、疱肉培养物、肉毒毒素

艰难梭菌革兰阳性粗大杆菌、芽孢位于菌体次级端，无荚膜严格厌氧在果糖卵黄琼脂平板上形成粗糙的黄色菌落脂酶－、卵磷脂酶－人和动物肠道中的正常菌群肠道菌群失调时可引起伪膜性肠炎粪便标本直接涂片检查见优势生长的革兰阳性粗大杆菌并有芽孢，具有诊断价值革兰阴性无芽孢厌氧菌类杆菌属肠道和女性生殖道主要菌群临床最重要的无芽孢厌氧菌普雷沃菌属卟啉单胞菌属梭杆菌属：菌体细长，两端尖细，中间膨大，革兰染色可见菌体中有紫色颗粒革兰阳性无芽孢厌氧菌丙酸杆菌属痤疮丙酸杆菌寄居人和动物皮肤、皮脂腺等部位，与痤疮有关优杆菌属乳杆菌属：女性生殖道主要正常菌群双歧杆菌属：人和动物肠道中重要的正常菌群，对维持人体内微生态平衡发挥重要作用厌氧性球菌消化球菌属：革兰阳性球菌消化链球菌属：革兰阳性球菌韦荣球菌属：革兰阴性球菌测验1正常人肠道中数量最多的细菌是

A大肠埃希菌

B

乳酸杆菌

C

粪肠球菌

D无芽孢厌氧菌

E芽孢厌氧菌测验2在无芽孢厌氧菌感染中，临床标本检出阳性率最高的是：

A脆弱类杆菌

B

双歧杆菌

C

丙酸杆菌

D

梭形杆菌

E

消化链球菌测验3下列对厌氧要求不严格的细菌是

A双歧杆菌

B

产气荚膜梭菌

C

破伤风梭菌

D

艰难梭菌

E

产黑色素类普雷沃菌测验4下列哪种细菌是条件致病菌

A脆弱类杆菌

B

淋病奈瑟菌

C

溶血性链球菌

D

肠产毒素性大肠杆菌

E

乙型副伤寒沙门菌测验5在牛乳培养基产生“汹涌发酵”现象的是

A破伤风梭菌

B产气荚膜梭菌

C

肉毒梭菌

D

艰难梭菌

E

诺维梭菌测验6关于艰难梭菌特点错误的是

A革兰阳性粗大杆菌

B

为肠道内正常菌群

C

在组织和培养时不易形成芽孢

D

是伪膜性肠炎最常见的病原菌

E所致疾病与长期使用抗生素有关测验7菌体细长，两端尖细，中间膨大，菌体中常有紫色颗粒（革兰染色），可能的细菌是

A产气荚膜梭菌

B梭杆菌

C

放线菌

D

双歧杆菌

E

脆弱类杆菌革兰阳性

需氧或兼性厌氧杆菌白喉棒状杆菌属棒状杆菌属是引起白喉的病原体主要以外毒素致病白喉棒状杆菌－－形态染色菌体为细长弯曲的杆菌，粗细不一，常一端或两端膨大呈棒状，故名为棒状杆菌。

直径为0.3~0.8μm，排列不规则，呈栅栏状、V字形或L字形；无荚膜，无鞭毛，不产生芽孢；革兰染色呈阳性，用美蓝或奈瑟染色后，菌体两端或一端可见着色较深的异染颗粒，有鉴定意义。白喉棒状杆菌－－培养特性需氧或兼性厌氧营养要求高菌落特征

●血平板：灰白、狭窄溶血环

●鸡蛋斜面和血清斜面：生长迅速，灰白色有光泽菌落

●亚碲酸钾血平板：为选择培养基，菌落呈黑色。菌落分为重型、轻型或中间型白喉棒状杆菌－－生化反应和抗原结构生化反应分解葡萄糖、麦芽糖、果糖等不分解乳糖、多数不分解蔗糖靛基质试验－、明胶液化－、尿素分解－抗原构造K抗原：型特异性抗原，不耐热O抗原：与分枝杆菌、诺卡菌有共同抗原白喉棒状杆菌－－临床意义致病物质：白喉外毒素由携带β-棒状杆菌噬菌体的白喉杆菌产生。抑制蛋白质的合成。经呼吸道飞沫感染，引起白喉。假膜脱落阻塞呼吸道是白喉早期死亡的主要原因中毒性心肌炎是白喉晚期死亡的主要原因抗白喉免疫主要依靠白喉抗毒素的中和作用锡克试验用于检测机体有无白喉抗毒素免疫白喉棒状杆菌－－检验程序咽拭标本亚碲酸钾血平板观察菌落特征直接涂片革兰染色异染颗粒染色血平板吕氏血清斜面直接涂片革兰染色异染颗粒染色涂片染色镜检生化反应毒力试验白喉棒状杆菌－－标本采集和检查方法咽拭标本标本直接涂片革兰染色：观察形态、染色性异染颗粒染色：观察异染颗粒初步报告：检出形似白喉棒状杆菌分离培养吕氏斜面：生长迅速，涂片镜检异染颗粒明显亚碲酸钾血平板：黑色菌落白喉棒状杆菌－－毒力试验意义：是鉴定白喉杆菌为致病菌株的重要依据方法艾立克平板毒力试验对流电泳法协同凝集试验动物实验第八节需氧芽孢杆菌属是一大群下枯杨，能产生芽孢的革兰阳性大杆菌。种类：炭疽芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌多粘杆菌等炭疽芽孢杆菌－－形态染色革兰阳性粗大杆菌，两端平截，呈竹节状，链状排列；可形成荚膜、芽孢（体内形成荚膜，体外形成芽孢），无鞭毛炭疽芽孢杆菌－－培养特性需氧或兼性厌氧营养要求不高，普通培养基上生长良好干燥、边缘不整的粗糙型菌落，低倍镜下边缘呈“卷发状”液体培养基中呈絮状生长明胶培养基中呈倒置的杉树有毒株在NaHCO3培养基中形成荚膜，菌落呈粘液状，有拉丝(有毒株)炭疽芽孢杆菌－－抗原结构与抵抗力抗原结构：※炭疽毒素：由保护性抗原、致死因子、水肿因子组成，具有毒性作用。三种成分单独存在无致病作用。※菌体抗原：耐热、耐腐败，能与相应抗体结合发生沉淀反应，用于Ascoli试验抵抗力：本菌芽孢抵抗力强，芽孢对碘和氧化剂敏感耐药性：本菌对青霉素、氨基糖甙类、四环素类、环丙沙星敏感炭疽芽孢杆菌－－临床意义致病物质炭疽毒素、荚膜所致疾病经多途径感染，引起炭疽病临床类型：肺炭疽、肠炭疽、皮肤炭疽、败血症属人畜共患传染病，死亡率高炭疽芽孢杆菌－－标本采集和处理标本采集病人血液、痰、粪便、渗出液、脑脊液等死亡病畜标本：死亡牲畜严禁宰杀污染物品：皮革、兽毛、土壤等标本处理：无杂菌污染标本直接接种，有杂菌污染标本先加热杀死繁殖体和杂菌再接种已处理标本直接涂片增菌培养分离培养Ascoli试验革兰染色荚膜染色初步报告血平板戊烷脒琼脂平板可疑菌落菌落涂片染色镜检鉴定试验肉汤培养动物实验动物死亡分离培养●噬菌体裂解●串珠试验●青霉素抑制试验炭疽芽孢杆菌－－检查方法涂片染色镜检革兰染色：涂片后升汞固定；发现革兰阳性粗大杆菌、有荚膜，竹节样排列可初步报告分离培养：污染的标本先加热处理再接种动物试验：注射部位胶样水肿，肝脾肿大，出血等。炭疽芽孢杆菌－－鉴定试验青霉素抑制试验：与其他需氧芽孢杆菌鉴别串珠试验：与其他类炭疽芽孢杆菌鉴别青霉素和串珠联合试验噬菌体裂解试验：与类炭疽芽孢杆菌鉴别重碳酸盐毒力试验植物凝集素试验Ascoli试验(环状沉淀试验)结果报告：经检验未发现炭疽芽孢杆菌经检验发现炭疽芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌革兰阳性杆菌，短链状排列，有芽孢和鞭毛菌落粗糙呈蜡状，β溶血，液体培养基中呈混浊和菌膜生长液化明胶、卵磷酯酶＋产生两种类型肠毒素，引起食物中毒微检：细菌培养鉴定、活菌计数定量（13～36×106）第九节霉菌与霉菌毒素的食品污染（moldsandmycotoxinscontamination）outline霉菌与霉菌毒素污染食品概述霉菌简介霉菌产毒的特点影响霉菌产毒的因素主要的霉菌毒素霉菌和霉菌毒素的食品卫生学意义黄曲霉毒素发现历史结构与特点污染食品的情况影响黄曲霉毒素产生的因素黄曲霉毒素的毒性黄曲霉毒素与人体健康预防措施霉菌与霉菌毒素污染食品概况霉菌是“丝状真菌”的统称，凡是在基质上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状菌丝体的真菌（fungi），都称为霉菌。霉菌及其产生的毒素对食品的污染以南方多雨地区为多见，目前已知的霉菌素素约有200余种，不同的霉菌其产毒能力不同，毒素的毒性作用也不同，按其化学性质可分为肝脏毒、肾脏毒、神经毒、细胞毒及性激素样作用。与食品关系较为密切的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、岛青霉素、黄天精、桔青霉素、展青霉素、单端孢霉素类、玉米赤霉烯酮、丁烯酸内醋等。

霉菌产毒的特点同一产毒菌株的产毒能力具有可变性和易变性。产毒株累代培养后可能失去产毒能力，而非产毒株在一定条件下可以产毒。产毒菌种产生的毒素不具有严格的专一性。一种菌种可产生几种毒素，同一毒素可由几种霉菌产生。产毒霉菌产生毒素需要一定的条件，霉菌污染食品并在食品上繁殖是产毒的先决条件，而霉菌能否在食品上繁殖与食品的种类和环境因素等各方面的影响有关。影响霉菌产毒的因素影响霉菌生长繁殖及产毒的因素很多，主要包括基质（食品）、水分、温度、湿度、空气流通等，为此，控制这些条件，可以对食品中霉菌分布及产毒造成很大的影响。

水分

霉菌生长繁殖主要的条件之一是必须保持一定的水分。食品的水分活度Aw表示可供微生物利用的水分含量，Aw越低，食品能提供给微生物生长所需的水分越少，越不利于微生物生长繁殖。当Aw在0.7以下时，霉菌的繁殖受到抑制，可以阻止霉菌的产毒。温度

温度对霉菌的繁殖及产毒均有重要的影响，不同种类的霉菌其最适温度是不一样的，大多数霉菌繁殖最适宜的温度为25-30℃，在0℃以下或30℃以上，不能产毒或产毒力减弱。一般来说，产毒温度略低于生长最适温度，如黄曲霉的最适产毒温度为28-32℃。基质

霉菌在天然食品上比在人工合成的培养基上更容易繁殖。此外，不同的霉菌菌种易在不同的食品中繁殖，即各种食品中出现的霉菌以一定的菌种为主。如玉米、花生以黄曲霉为主，小麦以镰刀菌为主，大米中以青霉为主。湿度在不同的相对湿度中，易于繁殖的霉菌也不同。相对湿度在80％以下时，主要是干生性霉菌（灰绿曲霉、白曲霉等）繁殖；相对湿度在80～90％时，主要是中生性霉菌（多数曲霉、青霉等）繁殖；相对湿度在90％以上时，主要为湿生性霉菌（毛霉）繁殖。空气流通大部分霉菌生长繁殖和产毒均需要氧气，少数霉菌（毛霉、灰绿曲霉）厌氧并可耐受高浓度的CO2。几种主要的霉菌毒素黄曲霉毒素岛青霉类毒素

岛青霉类毒素是由岛青霉产生的代谢产物，岛青霉为青霉属。国外报道的“黄变米”主要含有青霉属，最常分离的霉菌有黄绿青霉、岛青霉、和桔青霉等。“黄变米”是由于稻谷收割后，贮存中含水份过高，被霉菌污染后发生霉变所致，因为霉变呈黄色，故称“黄变米”。

岛青霉类毒素包括黄天精、环氯素、岛青霉毒素、红天精等。这些毒素易污染谷物，对人体危害所表现的毒性作用一般为三种类型，即急性毒性、亚急性和慢性毒性作用，并已证实黄天精和环氯素有致癌作用。镰刀菌毒素

镰刀菌毒素主要是镰刀菌属和个别其他菌属霉菌所产生的有毒代谢产物的总称。这些毒素主要是通过霉变粮谷而危害人畜健康。根据其化学结构和毒性作用可以主要分为单端孢霉素类、玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酮等几类毒素。单端孢霉素类

主要有T-2毒素、双乙酸蔗草镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇和镰刀菌烯酮-X等。急性毒性较强，以局部刺激症状、炎症甚至坏死为主，慢性毒性可引起白细胞减少，抑制蛋白质和DNA的合成。

玉米赤霉烯酮

又称F-2毒素等，以污染玉米、大麦、燕麦和小麦为主，具有类雌性激素样作用。丁烯酸内脂

是三线镰刀菌产生的一种水溶性有毒代谢产物，可引起牛烂蹄病，可引起后腿变瘸、蹄和皮肤联结处破裂、脱蹄。是一种血液毒，毒性也较大，尚不能排除致癌的可能性。霉菌和霉菌毒素的卫生学意义引起食品变质。食品霉菌污染程度及卫生质量评定：A.霉菌菌落总数B.霉菌菌相构成霉菌毒素引起人畜中毒。霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食，油料作物以及发酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。黄曲霉毒素发现历史上世纪60年代，在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关。进一步的调研证明，这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污染，这些研究工作最终使人们发现了黄曲霉（Aspergillusflavus）产生的有毒代谢物质，黄曲霉毒素（A-fla-toxins）。黄曲霉毒素（aflatoxin,AF)的结构和性质主要由黄曲霉、寄生曲霉（A.parasiticus）、模式曲霉（A.nominus）、黑曲霉（A.niger）产生。基本结构：两个呋喃环和香豆素。前者为基本毒性结构，后者与致癌作用有关。AFB1AFB2AFG1

AFT目前已分离鉴定出20余种异构体，其中最常见的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。特性：⑴紫外线下发不同颜色的荧光，蓝色荧光（Bluefluorescence）为B族，黄绿色荧光（yellow-Greenfluorescence）为G族；⑵呋喃环有双键者毒性强，具有致癌性；⑶溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂，不溶于水、乙醚、石油醚；⑷耐热，加热到280℃才裂解破坏；⑸在中性和酸性溶液中稳定，在pH值9～10的强碱性溶液中迅速分解。A.flavus主要产生B1和B2，世界范围分布。A.parasiticus主要产生B1、B2、G1、G2，分布于美洲和非洲。AFM1和AFM2为AFB1、AFB2的羟化衍生物，主要存在于奶（milk）及奶制品、肉类（meat）中，故名M族。AFT污染食品的情况黄曲霉毒素经常污染粮油及其制品。各种坚果、特别是花生和核桃中，大豆、稻谷、玉米、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。在我国，产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉，1980年测定了从17个省粮食中分离的黄曲霉1660株，广西地区的产毒黄曲霉最多，检出率为58%。总的分布情况为：华中、华南、华北产毒株多，产毒量也大，东北、西北地区较少。黄曲霉毒素产生的影响因素产毒菌株培养基：花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。温度和湿度：最适生长温度在37℃左右，产毒温度略低于最适生长温度，黄曲霉毒素产毒温度28～32℃，相对湿度85％以上。水分：产毒的适宜水分活度为0.8～0.9。氧气和二氧化碳浓度pH值：最适pH值为3光强度：较低时有利于产毒黄曲霉毒素的毒性急性毒性：剧毒物，毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。表现：⑴肝实质细胞坏死；⑵胆管增生；⑶肝细胞脂质消失延迟，形成脂肪肝；⑷肝出血。慢性毒性：动物生长迟缓，肝脏出现亚急性或慢性损伤，主要表现：⑴肝功能变化；⑵肝组织学变化；⑶食物利用率下降，体重减轻，生长发育缓慢。三致作用：致癌、致畸、致突变1988年，世界卫生组织(WHO)的国际肿瘤研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。1993年，IARC将黄曲霉毒素划定为1类致癌物。黄曲霉毒素与人类健康的关系人类主要是经进食受污染食物而摄取到黄曲霉毒素。虽然也可能透过呼吸而吸入这种霉菌，从工作环境而吸入这种霉菌的情况则不常见。黄曲霉毒素可引致动物急性及慢性中毒，其影响包括急性肝脏受损、肝硬化、引起肿瘤、形成畸胎及其他遗传影响。在现今社会里，人类因摄取到黄曲霉毒素而引起急性中毒的个案是很罕见。中毒病征可能包括发烧、呕吐及黄疸病，也可能引致急性肝脏受损，情况严重的会致命。长期摄取黄曲霉毒素与罹患肝癌有关。动物研究结果显示老鼠、仓鼠及猴子等动物经长期口服黄曲霉毒素后