食品分析1 蛋白质学习课件

第二章食品中蛋白质和氨基酸的测定第一节概述一、蛋白质和氨基酸的组成与分类

1．蛋白质和氨基酸的组成

C,H,O,N,S,P百分百50723160-30-3蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等蛋白质的分类

按营养功能分：完全蛋白质半完全蛋白质不完全蛋白质氨基酸的分类按营养功能分：必需氨基酸非必需氨基酸2．蛋白质和氨基酸的分类

二、食品中蛋白质的含量一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%

三、测定意义

生物活性功能性质营养标签四、蛋白质的一般性质

1．物理性质分子量很大黏度大渗透压低

2．化学性质显色反应沉淀作用变性作用一、蛋白质的分离和制备等电点沉淀；盐析和透析；凝胶柱层析；凝胶电泳第二节蛋白质的测定

二、蛋白质的定性测定1、蛋白质的一般显色反应一些染料与蛋白质结合并显色。2、复合蛋白质的显色反应糖蛋白的显色脂蛋白的显色蛋白质的测定方法分两大类：利用蛋白质的共性利用蛋白质中的特定基团具体测定方法：凯氏定氮法比色法（双缩脲反应，紫外，染料结合法仪器分析（红外分析仪，杜马斯）三、蛋白质含量的测定（一）凯氏定氮法

食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。蛋白质的含氮量一般为15%~17.6%，有的上下浮动,可以测出总氮.N/16%=N×6.25=蛋白质含量凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种[原理]样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。①用H3PO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。[步骤]整个过程分三步：

消化蒸馏吸收与滴定

1.消化

样品+浓硫酸加热

为了加快消化速度，一般添加硫酸钾、硫酸铜等催化剂，也可加入氧化剂。总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O图凯氏定氮消化装置1-水力真空管；2-水龙头；3-倒置的干燥管；4-凯氏烧瓶；消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。

图：凯氏定氮蒸馏装置；8-蒸馏烧瓶；10-进样漏斗；11-冷凝管；12-吸收瓶2.蒸馏

消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。

3.吸收与滴定<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，采用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿），国标用亚甲基兰+甲基红。硼酸呈微弱酸性(K＝5.8×10-10)，与氨形成强碱弱酸盐如酸标液滴定H2B4O7时，常用

甲基红4.4～6.2与溴甲酚绿4.0～5.6混合后，酸色为酒红色(红稍带黄)碱色为绿。当pH=5.1时，甲基红的橙色与溴甲酚绿的蓝色(蓝略带绿),互补为灰色。

酸性条件下：黄+红→酒红pH<5.1

碱性条件下：蓝+黄→绿色pH>5.1<2>待完全吸收后，用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。[结果计算]：式中——蛋白质的质量分数；

c——HCl标准溶液的浓度；

V1——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积；V2——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积；

m——样品质量，g；

M——氮的摩尔质量，14.01g／mol；

F——F——氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25，也可查表。

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麦粉K=5.79（N=17.6%）

动物胶K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%）

[说明]该法可用于所有食品的蛋白质分析。该法所测算出的结果应为粗蛋白。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。蒸馏装置不能漏气。

⑤

一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。微量凯氏定氮法

[原理]同常量凯氏定氮法

图：微量凯氏定氮装置1-蒸汽发生器；2-安全管；3-导管；4-汽水分离器；5-进样口；6-玻璃珠；7-反应管；8-隔离套；9-吸收瓶；10-冷凝管改良式凯氏定氮法【原理】同常量凯氏定氮法【注意事项】一般样品消化至蓝色或浅绿色并澄清后，继续消化30分钟即可。加碱蒸馏操作时，应确保整个蒸馏装置不漏气，加入氢氧化钠的速度要快蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。实验指导(3)5mL消化液(4)10mLNaOH溶液(5)水洗漏斗数次（6）夹闭漏斗通路，水封。（1）瓶内先装硼酸吸收液及混合指示剂（2）管下端插入液面下（8）冷凝开启（9）加热，蒸馏自动凯氏定氮仪称取样品（通常为一克）加入试剂，消解催化剂；在预定温度下将样品（6-40个随消化炉的不同而不同）同时消化（一般条件为420度，30-45分钟）；经冷却和稀释，一支消化管和接受瓶放置到仪器上。按下start键，起动碱泵加碱，蒸汽泵加蒸汽，硼酸泵向接受瓶中加硼酸。选择蒸馏时间四—五分钟，自动完成蒸馏；滴定，计算氮及蛋白含量。

用凯氏定氮法如何测蛋白氮？英文名：1,3,5-Triamine-2,4,6-Triazine中文名1,3,5-三氨基-2,4,6-三嗪其它名称蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺、蛋白精1.双缩脲分光光度比色法

（1）原理

二、比色法

（2）主要仪器

（3）试剂

（4）操作步骤（5）结果计算式中：m1——由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；

m——样品质量，g。（6）说明蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。含脂肪高的样品，易发生脂浑浊，应预先用有机溶剂除去。该方法测定范围为1~20mg蛋白质，灵敏度较低，适用于需要快速、但精确度要求又不高的蛋白质含量测定。常用于谷物蛋白质含量测定。

2.乙酰丙酮甲醛比色法

3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氢化吡啶（黄色）[原理]3.其他（1）紫外吸收【原理】

蛋白质分子中的酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸等残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的能力，特征吸收高峰在280nm波长处。【主要仪器】【试剂】

【操作步骤】【结果计算】(2)红外光谱法

【原理】【应用】(3)其他杜马斯法（燃烧法）水杨酸比色法福林-酚比色法考马斯亮蓝染料比色法第三节氨基酸总量的测定

1．单指示剂和双指示剂甲醛滴定法

2．

茚三酮比色法3．氨基酸自动分析仪法（简介）

甲醛滴定法

[原理]

单指示剂甲醛滴定法：[试剂]

（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1NNaOH溶液中和（淡兰色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100N

NaOH标准溶液。[操作步骤]

称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中（如为固体样加水50ml）→加两滴指示剂→用0.1NNaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡兰色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。氨基酸态氮=（N×V×0.014×100）/W×100

[计算]氨基酸态氮含量（%）=式中：

V1—用百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠量，ml。V2—用中性红作指示剂时，消耗氢氧化钠量，ml。C—氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L。M—样品质量，g。0.014—1/2氮的毫摩尔质量，g/mmol。

双指示剂甲醛滴定法

[原理]同单指示剂法[试剂]

中性红指示剂/百里酚酞指示剂[操作方法]

移取含氨基酸约20-30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液mL数。[计算]式中:--氨基酸态氮（%）C--氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）;V1--用中性红指示剂滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积（ml）;V2--用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（ml）;M--测定用样品溶液相当于样品的质量（g）;0.014为氮的豪摩尔质量（g/mmol）[说明及注意事项]（1）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。（2）若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。[原理]

利用各种氨基酸的不同性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基