蛋白质分析技术第九章课件

蛋白质分析技术第九章学习目标熟悉了解掌握1.蛋白质分离纯化基本原理2.SDS的原理，Westernblot原理SDS电泳的操作流程；Western印迹技术操作流程1.以Western为基础的相关技术第一节蛋白质的分离纯化第二节Western印迹技术01小节PART蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化是增加制品的纯度

总目标

尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求,纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高。总原则保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；蛋白质的分离纯化因标本而异。蛋白样品一般流程

前处理粗分离细分离结晶蛋白质的分离纯化盐析（A/G）、等电点沉淀、有机溶剂。凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析分离纯化的最后步骤(如有必要)生物样本蛋白质的释放（粉碎组织、裂解细胞）离心蛋白质粗提取液盐析有机溶剂沉淀等电点沉淀超速离心蛋白质粗品离子交换凝胶过滤亲和层析制备HPLC电泳蛋白质纯品预处理分离纯化蛋白质的分离纯化细胞破碎方法匀浆捣碎研磨机械法物理法化学法超声法反复冻融冷热交替法低渗裂解有机溶剂去污剂酶解法机体软组织动物韧性组织细菌、酵母细胞混悬液培养细胞细菌、病毒红细胞细菌、酵母组织、培养细胞细菌、酵母蛋白质的分离纯化一、机械法匀浆：将组织剪成小块，再加入3-5倍体积的预冷匀浆缓冲溶液，通过剪切力破坏组织和细胞。研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。物理法有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。化学法

1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。5）根据配体特异性，如亲和层析。蛋白质的分离纯化二、蛋白质混合物的分离方法超滤透析根据蛋白质分子大小不同根据蛋白质溶解度不同沉淀盐析吸附分离亲和层析蛋白质的分离纯化根据蛋白质的电荷不同采用配体特异性亲和力电泳离子交换超滤和透析利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。根据相对分子量不同的分离方法透析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态离心

应用强大的离心力，使物质因沉降速度不同而进行分离的方法叫离心技术。差速离心密度梯度离心等密度离心

差速离心密度梯度离心也称色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同，使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。层析利用各蛋白质分子大小不同分离凝胶法只适于球状蛋白分子测量凝胶过滤层析

样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得到分离。根据电荷不同的分离方法电泳

不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳动速度越大。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

在电解槽中放入两性电解质，通电即形成一个由阳→阴逐步递增的pH梯度。pH=pI时，Pro净电荷=0，所以Pro将聚焦于相当于pI的pH带内。

等电聚焦电泳(IEF)以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道。在高压作用下，带电粒子在毛细管内的溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流的矢量和。

毛细管电泳离子交换层析根据蛋白质分子在一定pH和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。二维电泳等电聚焦电泳和SDS的组合等电聚焦电泳双向电泳方法原理优点缺点凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高、不会引起变性凝胶介质昂贵、处理量有限离子交换层析各组份与离子交换剂亲和力不同分辨力高、处理量较大需酸碱处理树脂、操作耗时电泳法等电点、分子量、电荷的差异分辨力很高、可连续制备仪器试剂昂贵盐析法破坏水化膜和中和表面电荷操作简便、成本低、重复性好、对蛋白有保护作用分辨率差、纯化倍数低、沉淀中混杂盐分选择性沉淀等电点、热变性、酸碱变性等沉淀作用选择性较强、方法简便、种类较多应用范围较窄有机溶剂沉淀脱水作用和降低介电常数操作简便、分辨较强对蛋白质或酶有变性作用亲和层析蛋白质与配体之间特殊的亲和力分辨力很高局限性大高速与超速离心沉降系数或密度差异操作方便、容量大设备昂贵制备HPLC凝胶过滤、离子交换、反向色谱等分辩力很高、步骤少，仪器昂贵常用的蛋白质分离纯化方法

三、蛋白质分离纯化的条件缓冲溶液盐、金属离子和螯合剂还原剂去垢剂蛋白酶抑制剂表面效应蛋白质的环境因素温度储存

02小节PARTWestern印迹技术1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测——免疫印迹，Western印记杂交。Western印迹杂交/Westernblot（1）首先做蛋白质的