KTB9040-CN-过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（荧光法）

过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（荧光法）原理过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞、血清（浆）或其他液体等样本，其原理是在检测体系中过氧化氢酶（CAT）分解H2O2产生水和氧气，未分解的过氧化氢在酶和荧光物质存在下反应，其在激发波长535nm和发射波长587nm处的荧光强度与过氧化氢浓度成正比。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TAssayBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ50µL100µL-20℃，避光保存ReagentⅡ25µL50µL-20℃，避光保存ReagentⅢ25µL50µL-20℃，避光保存Standard(1M)0.4mL0.4mL-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·荧光酶标仪（激发波长为535nm，发射波长为587nm）·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头·低温离心机、恒温箱、制冰机·去离子水，PBS(pH7.0)·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。H2O2ReagentⅢ：临用前配制；取5μLReagentⅢ加入4.995mL去离子水，混匀，取15μL稀释后的ReagentⅢ，加入4.395mLAssayBuffer，混匀，现用现配，按需配制，当天内使用。WorkingReagent：临用前避光配制；取50μLReagentⅠ和20μLReagentⅡ，加入4.93mLAssayBuffer，充分混匀，该体积可用100次，按需配制，当天内使用，使用时须避光。Standard(1M)：使用前，用去离子水稀释10,000倍得到0.1mM标准品，充分溶解待用。用不完的Standard(1M)-20℃避光分装保存，避免反复冻融。注意：ReagentⅠ有毒，ReagentⅢ有腐蚀性，建议在通风橱进行实验。Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。序号0.1mM标准品体积（µL）去离子水体积（µL）标准品浓度（µM）Std.110010050Std.28012040Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.651952.5Std.72.5197.51.250（空白孔）02000注意：稀释的标准品溶液现配现用，尽快检测，不宜长久放置。样本制备注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。1.动植物组织：称取0.1g样本，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。3.血清或其他液体样本：10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。注意：1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本用AssayBuffer稀释成不同浓度进行预实验，根据预试验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.01-10U/mL，请参考下表稀释（仅供参考）。样本稀释倍数样本稀释倍数10%小鼠脑30-6010%小鼠肺150-300胎牛血清2-10293cells4-10人唾液30-60L929细胞上清不稀释人尿液30-5010%烟草叶2-6如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.荧光酶标仪预热到37℃，调节激发波长为535nm，发射波长为587nm。2.操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：试剂测定孔（μL）对照孔（μL）标准孔（μL）样本2500Standard0025去离子水0025H2O2ReagentⅢ25250酶标仪上振板10s，37℃反应5minWorkingReagent505050样本0250混匀，室温避光静置10min，荧光酶标仪上设置激发波长535nm，发射波长587nm，测定各孔荧光值，分别记为RFU测定、RFU对照、RFU标准和RFU空白，计算ΔRFU测定=RFU对照-RFU测定，ΔRFU标准=RFU标准-RFU空白。结果计算标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔRFU标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU测定带入方程得到x(μM)。CAT活性的计算：按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：37℃条件下，每mg蛋白每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mgprot)=x×f÷5÷Cpr按样本鲜重计算：酶活单位定义：37℃条件下，每g组织每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/g鲜重)=x×f÷5÷W按照细胞数量计算酶活单位定义：37℃条件下，每104个细胞每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/104cell)=x×f÷5÷N按液体体积计算：酶活单位定义：37℃条件下，每mL液体每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mL)=x×f÷5Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；5：反应时间，5min；f：样本稀释倍数；W：样品质量，g；N：细胞总数，万。结果展示ΔRFU标准ΔRFU标准H2O2Standard(μM)Figure1.CAT的标准曲线示例：取0.16g小鼠脑加入1mLAssayBuffer进行匀浆研磨，离心取上清稀释50倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为10,395，RFU对照为16,600，RFU空白为305，ΔRFU测定=16,600-10,395=6,205，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为10.04µM，CAT（样本）=10.04×50÷5÷0.16=627.5U/g鲜重。取胎牛血清离心取上清稀释5倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为6,380，RFU对照为13,390，RFU空白为305，ΔRFU测定=13,390-6,380=7010，标准曲线为y=568.3x+501.83，H2O2浓度为11.45µM，CAT（样本）=11.45×5÷5=11.45U/mL。相关产品 CatalogNo.ProductNameKTB9050CheKine™P